6. Cấu trúc của luận văn
2.2. SƠ ĐỒ QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM
2.3. NGUYÊN LIỆU 2.3.1. Cây bứa pH Thể tích Thời gian Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng Đo phổ IR Đo phổ HPLC Canxi hydroxycitrat tinh khiết Tinh chế Xác định hàm lƣợng canxi Tổng hợp Canxi hydroxycitrat Xác định tổng lƣợng axit Định lƣợng các axit (HPLC) Dịch chiết HCA Chiết tách HCA Hàm lƣợng tro Thành phần kim loại
Nguyên liệu sau khi xử lý Xử lý nguyên liệu Xác định độ ẩm Quả bứa Làm sạch Hong khô Xay nhỏ
Cây cao 6- 7m. Cành và nhánh dài, mảnh, mọc xoè ngang. Vỏ cây màu xám tro. Lá mọc đối, mép nguyên, nhẵn bóng, có nhiều điểm mờ. Vỏ quả màu vàng ở ngoài, phía trong hơi đỏ, vị chua, có nhiều múi mọng nƣớc, ăn đƣợc. Hoa có màu vàng nhạt, mọc thành chùm. Quả chín thƣờng đƣợc hái về ăn, vỏ quả phơi khô dùng làm thuốc chữa một số bệnh. thu hái vào các tháng 6-7, quả mọng mang đài tồn tại, vỏ quả dày, có khía múi, phía trong hơi đỏ chứa 6-10 hạt (hình 2.3).
Hình 2.3. Cây và quả bứa ở Quảng Ngãi 2.3.2. Thu nguyên liệu
Nguyên liệu đƣợc lấy ở xã Bình Hải và xã Bình Hoà , huyện Bình Sơn, tỉnh Quảng Ngãi. Chọn các loại quả chín có vỏ màu vàng, mềm, ít nhựa, dễ dùng dao để tách lấy vỏ. Cơm bao quanh hạt dày, rõ ràng, màu trắng vàng xem hình 2.4.
Hình 2.4. Quả bứa ở Quảng Ngãi 2.3.3. Xử lý nguyên liệu
Qủa bứa sau khi thu hái còn chứa nhiều tạp chất. Do đó, giai đoạn làm sạch nguyên liệu càng cẩn thận thì hiệu quả của các quá trình chiết tách sau này càng cao. Đầu tiên, nguyên liệu đƣợc thu nhận về cần loại bỏ những quả bị hƣ tổn, quả xanh, loại bỏ hết bụi bẩn, tạp chất bằng cách rửa bằng nƣớc sạch và lau khô bằng vải sạch. Sau khi khô nƣớc, cắt bỏ cuống quả, tách bỏ ruột chỉ lấy phần vỏ và tiến hành làm sạch ruột và hong khô phần vỏ của quả. Vỏ bứa đem sấy khô rồi xay thành bột.
Hình 2.5. Vỏ bứa đã làm sạch
2.4. XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT VẬT LÝ
2.4.1. Xác định độ ẩm
Dụng cụ, thiết bị: Cốc thủy tinh để đựng mẫu, tủ sấy, bình hút ẩm, cân phân tích
Cân khoảng 10g vỏ bứa tƣơi cho vào cốc thủy tinh đã đƣợc sấy khô và biết khối lƣợng chính xác, sau đó cho vào tủ sấy và sấy ở nhiệt độ 800
C trong 3h. Sau khi sấy ta lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc thủy tinh nguội hẳn thì tiến hành cân tính khối lƣợng trên cân phân tích. Sau đó cứ khoảng 30 phút ta lại tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lƣợng giữa hai lần cân liên tiếp là không đổi hay có sai số khoảng 0,005g thì dừng quá trình sấy.
Hình 2.6. Mẫu vỏ quả bứa khô
Dựa vào các kết quả thu đƣợc, ta tính đƣợc khối lƣợng vỏ quả Bứa trƣớc và sau khi sấy. Từ đó, ta tính đƣợc độ ẩm trong vỏ Bứa dựa vào công thức sau: 100 1 o o m m m H Trong đó: - H: độ ẩm (%)
- m0: khối lƣợng vỏ quả tƣơi trƣớc khi sấy (g) - m1: khối lƣợng vỏ quả sau khi sấy (g)
2.4.2. Xác định hàm lƣợng tro
Dụng cụ, thiết bị: Cốc sứ đựng mẫu, lò nung, bình hút ẩm, cân phân tích.
Cân khoảng 4g vỏ đã đƣợc sấy khô cho vào cốc sứ đã sấy khô và biết chính xác khối lƣợng. Cho cốc sứ có chứa vỏ vào lò nung và nung ở 8000
C. Sau 6h ta thấy vỏ đã đƣợc tro hóa hoàn toàn. Lúc này tro có dạng bột mịn, màu trắng. dùng kẹp dài lấy bát sứ ra khỏi lò nung, cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc nguội hẳn thì cân cốc trên cân phân tích và tính khối lƣợng.
Sau 30 phút tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lƣợng giữa hai lần liên tiếp là không đổi hay sai số 0,0001 g thì dừng quá trình tro hóa. Hàm lƣợng tro trong vỏ đƣợc tính theo công thức:
100 0 1 m m H
Trong đó: - H: hàm lƣợng tro trong vỏ sấy khô (%) - m0: khối lƣợng vỏ khô trƣớc khi tro hóa (g) - m1: khối lƣợng vỏ sau khi tro hóa (g)
2.4.3. Xác định hàm lƣợng một số kim loại bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)
Dùng cân phân tích cân chính xác từ 1- 1,5g mẫu, cho vào chén sứ nung ở 7000C trong 6 giờ đến khi mẫu khô và chuyển sang màu trắng.Trƣờng hợp mẫu khô nhƣng chƣa có màu trắng, ta thêm 2- 3 giọt HNO3 vào; tiếp tục
nung cho đến khi khô và xuất hiện màu trắng. Để nguội chén sứ, đem định mức thành 50ml bằng nƣớc cất rồi tiến hành đo quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) để xác định hàm lƣợng một số kim loại trong vỏ quả bứa khô.
2.4.4. Chuẩn độ tổng lƣợng axit thu đƣợc bằng phƣơng pháp chuẩn độ axit- bazơ axit- bazơ
Pha chính xác 1 lít dung dịch NaOH chuẩn 0,1N từ fixanal, rồi sau đó dùng phễu rót vào buret sạch đến vạch số 0. Dùng pipet lấy vào 3 bình nón đã rửa sạch và tráng bằng nƣớc cất mỗi bình 5ml dung dịch chiết (đã đƣợc tẩy màu) và thêm 1- 2 giọt phenolphtalein. Tiến hành chuẩn độ cho đến khi dung dịch có màu hồng bền vững trong 30 giây. Xác định hàm lƣợng axit tổng số trong vỏ quả bứa theo tiêu chuẩn TCVN 4589-88. Nhỏ NaOH 0,1N từ buret
xuống, cho đến khi dịch thử có màu hồng nhạt bền vững.
Tính kết quả: Độ axit toàn phần theo phần trăm (X1) tính bằng công thức: Trong đó:
n : số ml NaOH 0,1N sử dụng để chuẩn độ V ml dịch thử; Vcd : thể tích mẫu cô đặc (ml);
P : trọng lƣợng mẫu thử, tính bằng gam; K: hệ số của loại axit, K = 0,006904.
Dùng phƣơng pháp chuẩn độ để xác định tổng lƣợng axit hữu cơ có trong mẫu chiết.
2.4.5. Chƣng ninh bằng nồi áp suất để thu dịch chiết axit
Vỏ quả bứa khô: Quả bứa sau khi rửa sạch, hong khô tiến hành bổ quả để loại bỏ ruột và hạt. Vỏ quả đƣợc cắt thành mẫu nhỏ có kích thƣớc bằng ngón tay út đem sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 800C trong vòng 28 giờ đến khi vỏ quả khô hoàn toàn, xay vỏ quả khô thành bột mịn và sử dụng để chiết hữu cơ. P V Vcd n K X . . .100 1
Chƣng ninh trong nồi áp suất: Cân chính xác khoảng 10g mẫu vỏ quả khô, cho vào cốc thuỷ tinh 500ml với 200ml nƣớc cất. Thực hiện chƣng ninh trong nồi áp suất trong thời gian 90 phút. Thu đƣợc dung dịch chiết, phần bã rắn đƣợc chiết lặp lại một lần nữa để thu hồi toàn bộ lƣợng axit có trong mẫu. Dịch chiết thu đƣợc có màu nâu đỏ. Trộn dịch chiết với 4 gam than hoạt tính và ngâm trong nƣớc ấm 30 phút, sau đó lọc than hoạt tính, rửa lại 2 lần, mỗi lần 10ml nƣớc để thu hồi hết axit. Dịch chiết sau khi xử lý bằng than hoạt tính bị mất màu hoàn toàn. Trộn lẫn dịch lọc và rửa, cô đặc đến 50ml, xử lý với 100ml etanol, để yên 15 phút để kết tủa hết pectin (kết tủa màu trắng sữa). Lọc bỏ kết tủa. Phần kết tủa rửa 2 lần để thu hồi hết axit. Trộn các dịch chiết, cô đặc đến thể tích 50ml và lƣu giữ ở 40C trong tủ lạnh đến khi sử dụng để chuẩn độ, kiểm tra bằng HPLC.
Hình 2.8. Dịch chiết chưa tẩy màu
Hình 2.9. Dịch
chiết đã tẩy màu Hình 2.10. Dịch chiết sau khi cô đặc
2.4.6. Xác định hàm lƣợng HCA trong mẫu bằng phƣơng pháp HPLC[12] [12]
HPLC phân tích: Hệ thống sắc ký lỏng cao áp đƣợc sử dụng để nghiên cứu gồm máy sắc kí lỏng cao áp hãng Knauer trang bị với bơm loại áp suất thấp hãng Knauer, và lắp cột sắc kí Knauer C18: 250 mm x 4,6 ID x 5m. Bộ tổng hợp dung môi: quaternary LP Gradient, hãng Knauer. Quá trình dò đƣợc thực hiện bằng đetectơ Knauer UV: khoảng bƣớc sóng 190- 740 nm.
Pha động gồm (A) metanol MeOH và (B) là H3PO4 0,01 M với tốc độ dòng 1,5 ml/m. Quá trình tách các pic tốt khi chất A trong B thay đổi từ 10- 30% trong thời gian 0- 25 phút, 90% A trong B trong thời gian 30 phút, sau 5 phút cân bằng với 90% A. Chất chuẩn và mẫu đƣợc lọc qua Millipore lọc 0,45
m và tiêm vào HPLC.
Xây dựng đƣờng chuẩn:
Phƣơng pháp xây dựng đƣờng chuẩn đƣợc thực hiện bằng cách dựa vào kết quả phân tích một chuỗi các mẫu HCA chuẩn. Năm mẫu dung dịch chuẩn chứa 10- 32ppm HCA tự do đƣợc tiêm vào HPLC, thao tác rửa giải đƣợc thực hiện nhƣ phần thảo luận ở trên, và kết quả thu đƣợc các diện tích pic. Đƣờng cong HCA đƣợc vẽ dựa trên biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ của HCA và diện tích pic (trung bình của 3 lần chạy).
Khoảng nồng độ mẫu chuẩn cần để xây dựng đƣờng chuẩn đƣợc xác định dựa vào nồng độ thực của HCA có trong mẫu. Khoảng nồng độ này tính từ giá trị giới hạn dƣới (LLOQ) đến giá trị giới hạn trên (ULOQ).
Xác định giá trị giới hạn: Giá trị giới hạn (LOQ) đƣợc định nghĩa nhƣ nồng độ thấp nhất của HCA mà có thể xác định với độ tin cậy và chính xác <20%.
Xác định axit hữu cơ có trong mẫu: Mẫu đƣợc chuẩn bị bằng cách pha loãng theo tỉ lệ 1:100 với nƣớc cất 2 lần cất, vỏ quả chƣng ninh với nƣớc cất tỉ lệ 1:50. Thể tích của mỗi mẫu đƣợc tiêm vào HPLC là 20l, HCA thu đƣợc trực tiếp dựa vào diện tích pic, bằng cách áp dụng hệ số pha loãng và sử dụng
đƣờng chuẩn. Nồng độ của HCA trong mẫu đƣợc tính bằng g/100g mẫu dựa theo công thức sau:
000 . 10 ) ( % Mn Kpl Vdm Int Am SI HCA
Trong đó: SI: hệ số góc đƣờng chuẩn; Int: hệ số b của đƣờng chuẩn; Am: diện tích pic sắc kí; Vdm: thể tích mẫu sau khi cô đặc dùng cho HPLC; Kpl: hệ số pha loãng; Mn: khối lƣợng mẫu (gam).
Chất chuẩn: (-)-Calcium threo-hydroxycitrat tribasic hydrate, cung cấp bởi hãng Sigma-Aldrich, công thức C12H10Ca3O16.xH2O. Thông tin chi tiết của chất chuẩn nhƣ sau:
Tên sản phẩm : (-)-Calcium threo-hydroxycitrat tribasic hydrate, BioChemika, Garcinia Cambogia Extract, ~19,5% Ca.
Số sản phẩm : 55128
Văn phòng sản xuất : Fluka.
Công thức phân tử : C12H10Ca3O16.xH2O.
Khối lượng phân tử : 530,43 (cơ bản khan).
Màu sắc : Hơi nâu.
Dạng tồn tại : Bột.
Chuẩn độ (trao đổi ion) : Axit threo-hydroxycitric 67,3%.
Hàm lượng cacbon : 24,11%.
Hàm lượng Hiđro : 2,82%.
Phổ 1
HNMR : Phù hợp.
Toàn bộ những thông tin trên đƣợc ghi trong Giấy chứng nhận chất lƣợng ngày 4 tháng 2 năm 2005 của hãng Sigma-Aldrich.
Chuẩn bị HCA tự do: Calcium threo-hydroxycitrat tribasic hydrate (50mg) cho vào cốc 50ml chứa 5ml nƣớc, và xử lý với 500mg Dowex 50 [H+]. Hỗn hợp đƣợc khuấy trong thời gian 10 phút, sử dụng khuấy từ. Tách lấy phần dung dịch, và nhựa đƣợc rửa với nƣớc có pH trung tính. Nƣớc rửa và dung dịch đƣợc trộn lẫn tới thể tích 25ml, khuấy trộn và lọc bằng giấy lọc. Chuẩn bị 5 dung dịch chuẩn HCA có nồng độ thay đổi từ 10ppm đến 320ppm.
2.4.7. Tổng hợp muối canxihydroxycitrat của HCA
Dịch chiết sau khi cô đặc đƣợc trung hòa axit bằng cách cho thêm dung dịch CaCl2 (32g/100ml dịch). Dung dịch thu đƣợc đƣợc khuấy trộn khoảng 30-120 phút. Khi thêm CaCl2 vào, lúc đầu xuất hiện ít kết tủa trắng, sau xuất hiện ngày càng dày đặc tạo thành bùn, pH của hỗn hợp bùn thích hợp từ 9,5- 11. Sử dụng dung dịch NaOH 10% (44,4g/400ml nƣớc) để chỉnh độ pH. Hỗn hợp bùn đƣợc lọc và rửa với nƣớc cất để loại bỏ tất cả muối bám vào. Nƣớc rửa ra đƣợc kiểm tra ion clorua và việc lọc rửa kết thúc khi không còn phát hiện ion clorua trong nƣớc rửa. Phần bánh ƣớt đƣợc sấy khô ở nhiệt độ 1000
C để thu đƣợc dạng bột khô màu nâu xám là muối HCCa. Tiến hành cân khối lƣợng để tính toán hiệu suất của quá trình chuyển hóa.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. MỘT SỐ TÍNH CHẤT VẬT LÝ CỦA NGUYÊN LIỆU 3.1.1. Độ ẩm của nguyên liệu
Bằng phƣơng pháp trọng lƣợng, độ ẩm của nguyên liệu đƣợc xác định và tổng hợp ở bảng kết quả 3.1
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm trong vỏ quả bứa sấy khô STT
mẫu
Khối lƣợng vỏ trƣớc khi sấy (g)
Khối lƣợng vỏ sau khi sấy (g)
Khối lƣợng nƣớc trong vỏ (g) Độ ẩm (%) 1 10,097 9,249 0,848 8,39 2 10,098 9,277 0,821 8,13 3 10,099 9,230 0,869 8,61
Nhận xét: Độ ẩm trong vỏ quả bứa khô khoảng 8,37 ± 0,24%, độ ẩm trung bình trong vỏ quả bứa là 8,37%. Với độ ẩm này, tôi đã bảo quản nguyên liệu trong thời gian dài làm thí nghiệm nhƣng không bị hƣ hỏng.
3.1.2. Hàm lƣợng tro
Kết quả xác định hàm lƣợng tro của nguyên liệu đƣợc trình bày ở bảng 3.2 nhƣ sau: Bảng 3.2: Kết quả xác định tỉ lệ tro trong vỏ quả bứa sấy khô
STT mẫu Khối lƣợng vỏ đã sấy khô (g) Khối lƣợng cốc (g) Khối lƣợng vỏ sấy khô + cốc trƣớc khi tro hóa (g) Khối lƣợng vỏ + cốc sau
khi tro hóa (g) Khối lƣợng tro (g) Tỉ lệ tro (%) 1 4,039 16,750 20,789 16,792 0,042 1,04 2 4,150 19,560 23,710 19,603 0,043 1,03 3 4,221 32,120 36,341 32,166 0,046 1,09
Nhận xét: Hàm lƣợng tro trong vỏ quả bứa khô khoảng 1,06 ± 0,03 %. Hàm lƣợng tro trong vỏ quả bứa khô là rất thấp, chiếm khoảng 1,05 % khối lƣợng vỏ quả bứa khô.
3.1.3. Xác định thành phần kim loại bằng phƣơng pháp AAS
Kết quả xác định hàm lƣợng một số kim loại trong vỏ bứa khô bằng phƣơng pháp đo AAS đƣợc xác định ở bảng 3.3
Bảng 3.3. Kết quả xác định hàm lƣợng một số kim loại trong vỏ bứa STT Tên kim loại Phƣơng pháp thử AAS Kết quả (mg/L) Hàm lƣợng cho phép (mg/kg) 1 Sn TCVN 6193-1996 0,0043 40 2 Pb TCVN 6193-1996 0,6715 2 3 Zn TCVN 6193-1996 5,3224 40 4 Cu TCVN 6193-1996 2,2675 30 5 Fe TCVN 6177-1996 26,512 x 6 As TCVN 6193-1996 KPH 1 7 Tổng Cu, Zn, Fe 30,1019 x
Nhận xét: Thành phần kim loại nặng trong vỏ quả bứa thấp, kết quả so sánh với tiêu chuẩn CODEX STAN 164 – 1989: Tiêu chuẩn về chất lƣợng trái cây và hàm lƣợng kim loại nặng cho phép trong các loại rau quả quy định tại Quyết định số 867/1998/QĐ – BYT của Bộ Y Tế ngày 4/4/1998 về việc ban hành Danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lƣơng thực, thực phẩm thì các hàm lƣợng kim loại nặng nằm trong khoảng cho phép. Nhƣ vậy có thể sử dụng vỏ quả bứa để làm thực phẩm hoặc dƣợc phẩm mà không ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời.
3.1.4. Xác định tổng lƣợng axit trong mẫu chiết bằng phƣơng pháp chuẩn độ chuẩn độ
Kết quả xác định tổng lƣợng axit trong mẫu chiết từ vỏ quả bứa khô bằng phƣơng pháp chuẩn độ thu đƣợc kết quả trình bày ở bảng 3.4 dƣới đây.
Bảng 3.4. Kết quả xác định tổng lƣợng axit trong vỏ quả bứa
Mẫu Dung môi chiết STT P (g) Vcd (ml) V (ml) n (ml) TB 3 lần chuẩn Tổng lƣợng axit (g/100g) Tổng lƣợng axit trung bình (g/100g)
Vỏ quả Bứa khô Nƣớc 1 10,000 50 5 25,9 17,88 16,06 26,0 17,95 26,1 18,02 2 10,095 50 5 23,9 16,35 24,0 16,42 24,1 16,48 3 10,105 50 5 20,2 13,80 20,3 13,87 20,1 13,73
Nhận xét: Tổng lƣợng axit chuẩn độ đƣợc trong mẫu vỏ bứa khô chiết với dung môi nƣớc là 16,06%. So sánh với kết quả của các loài đã nghiên cứu nhƣ: Garcinia cambogia (17 – 19,2%), Garcinia india (12,48 – 15,1%), Garcinia cowa (27,1%) thì kết quả vỏ quả bứa Quảng Ngãi chiết trong nƣớc cho kết quả trung bình.
3.2. XÁC ĐỊNH HCA TRONG MẪU CHIẾT BẰNG SẮC KÝ LỎNG
CAO ÁP (HPLC)
Axit HCA có khuynh hƣớng bị lacton hóa trong suốt quá trình gia nhiệt. Đối với phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp ta có thể định lƣợng HCA và