6. Cấu trúc của luận văn
3.3.5. Kiểm tra sản phẩm muối HCCa bằng phổ hồng ngoại (IR)
Để kiểm tra sản phẩm muối HCCa tạo thành ta chụp phổ hồng ngoại IR so với phổ hồng ngoại của canxihydroxycitrat chuẩn.
Hình 3.10. Máy đo phổ hồng ngoại (IR) 13.5 14 14.5 15 15.5 16 16.5 17 30 60 90 120 Thời gian khuấy trộn (phút) Khối lƣợng muối thu đƣợc (g)
Hình 3.12. Phổ IR của muối HCCa
Kết quả chụp phổ IR của muối canxihydroxycitrat (HCCa) (hình 3.12 ) so với muối canxihydroxycitrat (HCCa) chuẩn (hình 3.10) cho thấy xuất hiện các píc lần lƣợt có bƣớc sóng 3310 cm-1 ứng với phổ dao động của nhóm
–OH và có píc ứng với bƣớc sóng 1582 cm-1
ứng với nhóm C=O trong nhóm (-COO)2Ca. Về hình dáng, phổ IR của muối HCCa và HCCa chuẩn tƣơng tự nhau.
3.4.6. Kiểm tra sản phẩm muối HCCa bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
Để kiểm tra sản phẩm muối tạo thành ta tiến hành kiểm tra sản phẩm muối HCCa thu đƣợc bằng phổ HPLC rồi so sánh với phổ HPLC của (-)- HCCa chuẩn.
Đo HPLC bằng máy D-7000HPLC, điều kiện sắc kí cột sắc kí RP 18, 5µm, 4,6x250mm, dung môi A: pha động H3PO4 0,1%; dung môi B: ACN ( 95:5), detector: 205nm, tốc độ dòng 1ml/phút. Đo tại công ty dƣợc Danapha Đà Nẵng.
Kết quả kiểm tra bằng phổ HPLC thể hiện ở hình 3.13 và hình 3.14 dƣới đây:
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 RetentionTime(min) 0 5 10 15 20 Intensity (mV) STD Hình 3.13. Phổ HPLC của (-)-HCCa chuẩn
CAL CIU M H YDR OXY CIT RAT E 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Retention Time (min)
0 2 4 6 8 10 Intens ity (m V)
Hình 3.14. Sắc kí đồ của muối HCCa
Nhận xét:
Kết quả đo phổ HPLC cho thấy thời gian lƣu của muối HCCa đã tổng hợp là 3,89 phút. So sánh với kết quả đo HPLC của HCCa chuẩn có thời gian lƣu là 3,804 phút. Do đó có thể kết luận là đã tổng hợp thành công muối HCCa.
Tuy nhiên, trên phổ đồ tổng hợp xuất hiện 2 số pic nhỏ. Nhƣ vậy, ngoài thành phần chính của muối tổng hợp đƣợc HCCa còn có lẫn 1 ít tạp chất nên chúng ta cần phải tinh chế muối HCCa đã tổng hợp. Hàm lƣợng HCCa trong muối đã tổng hợp đƣợc xác định bằng HPLC là 91,351%.
3.5. TINH CHẾ MUỐI
Muối HCCa điều chế ở trên có độ tinh khiết là 91,351% .Nó cần phải đƣợc tinh chế để xác định cấu trúc và sử dụng làm thực phẩm chức năng .
2,35
3,89
Quá trình tinh chế muối HCCa đƣợc thực hiện nhƣ sau: Cho sản phẩm muối HCCa đƣợc điều chế ở dạng rắn ta đi rửa nhiều lần bằng nƣớc cất cụ thể nhƣ sau:
-Lần 1: muối HCCa khi ta tổng hợp muối từ nấu 100gam mẫu ta rửa 10 lần bằng 5lít nƣớc cất. Sấy khô ở 800
C trong 24h . Lấy mẫu đo HPLC tại công ty danapha Đà Nẵng (hình 3.16).
- Lần 2: Lấy sản phẩm lần 1 tiến hành rửa và lọc 10 lần bằng 5lít nƣớc cất. Lọc chất rắn, sấy khô sau đó tiến hành đo HPLC ( hình 3.17).
- Lần 3: Lấy sản phẩm lần 2 tiền hành rửa và lọc 10 lần bằng 5lít nƣớc cất 10 lần. Lọc chất rắn, sấy khô sau đó tiến hành đo HPLC( hình 3.18).
CA LC IU M HY DR OX YC IT RA TE 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Retention Time (min)
0 2 4 6 8 10 Inte nsit y (m V)
Hình 3.16. Sắc kí đồ của muối HCCa tinh chế lần 1
CA LC IU M HY DR OX YC IT RA TE 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Retention Time (min)
0 2 4 6 8 10 Inte nsit y (m V)
CA LC IU M HY DR OX YC IT RA TE 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Retention Time (min)
0 2 4 6 8 10 12 Inte nsit y (m V)
Hình 3.18. Sắc kí đồ của muối HCCa tinh chế lần 3 Nhận xét:
Dựa vào 3 sắc kí đồ trên cho ta kết quả bảng 3.9 nhƣ sau:
Bảng 3.9. Kết quả diện tích pic của phổ HPLC của sản phẩm muối HCCa
pic pic
1 3.16 3,90 99179 92,428
2 3.17 3,90 100970 93,089
3 3.18 3,91 103050 93,589
Sau khi ta tiến hành rửa sạch chất rắn thì các tạp chất giảm thế hiện qua 02 pic nhỏ có thời gian lƣu 2,36 và 2,89 phút. Pic thể hiện muối HCCa có diện tích lớn nhất và đạt đƣợc độ tinh khiết 93,589%.
3.6. KIỂM TRA HÀM LƢỢNG CANXI TRONG SẢN PHẨM MUỐI HCCa HCCa
Tiến hành kiểm tra hàm lƣợng canxi có trong sản phẩm muối HCCa tạo thành bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS). Kết quả xác định hàm lƣợng canxi trong muối HCCa tạo thành đƣợc thể hiện ở bảng 3.10 dƣới đây:
Bảng 3.10. Kết quả hàm lƣợng canxi trong muối HCCa bằng AAS Kim loại Phƣơng pháp thử (AAS) Kết quả (mg/L) Hàm lƣợng cho phép (mg/L) Canxi TCVN 6660 - 2000 17292,1 –
Nhận xét: Hàm lƣợng canxi trong sản phẩm HCCa là thành phần kim loại chính, kết quả canxi xác định đƣợc bằng phƣơng pháp AAS là 17292,1 mg/L (chiếm 17,29%). Nhƣ vậy có thể sử dụng sản phẩm HCCa tạo thành để làm thực phẩm hoặc dƣợc phẩm mà không ảnh hƣởng đến sức khoẻ con ngƣời theo quyết định số 867/1998/QĐ-BYT của Bộ Y Tế ngày 4 tháng 4 năm 1998 về việc ban hành Danh mục Tiêu chuẩn vệ sinh đối với lƣơng thực, thực phẩm
3.7. KIỂM TRA CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG SẢN PHẨM MUỐI HCCa. MUỐI HCCa.
Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật mẫu muối HCCa nhƣ sau: Bảng 3.10. Kết quả xác định một số chỉ tiêu vi sinh của muối
canxihydroxycitrat.
TT Tên chỉ tiêu Đơn vị tính Phƣơng pháp thử Kết quả thử nghiệm 1 Tổng vi khuẩn đếm đƣợc kl/g TCVN 4884:2005 KPH 2 E. coli kl/g FAO KPH 3 Tổng bào tử nấm men - mốc kl/g TCVN 4993-89 KPH
Ghi chú: - Kph: không phát hiện
Nhƣ vậy, kết quả phân tích cho thấy mẫu muối canxihydroxycitric thỏa mãn Tiêu chuẩn vi sinh cho phép trong thực phẩm của Bộ Y tế.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
Trong đề tài nghiên cứu chúng tôi đã thu đƣợc một số kết quả nhƣ sau: 1/ Độ ẩm trong vỏ bứa khô: 8,37 %, Hàm lƣợng tro trong vỏ bứa khô:1,06 %
Thành phần kim loại nặng gồm: Sn(0,0043mg/L),
2/ Chứng minh đƣợc sự có mặt của HCA trong vỏ quả bứa bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Hàm lƣợng (-)-HCA tìm thấy trong vỏ quả bứa khô (15,348%), axit thứ yếu là axit citric (0,413%). Xác định đƣợc tổng lƣợng axit có trong mẫu chiết là 16,06 (g/100g).
3/ Đã khảo sát và xây dựng quy trình chuyển hoá tạo muối canxi của HCA chiết từ vỏ bứa khô. Khối lƣợng muối HCCa ở dạng rắn tạo thành trung bình là 16,698 g/100g mẫu, hiệu suất tạo muối vào khoảng 77,871% – 86,295%.
4/ Đã kiểm tra sản phẩm muối HCCa tạo thành bằng phổ hồng ngoại (IR), sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Hàm lƣợng muối HCCa trong sản phẩm chuyển hoá là 93,589% ứng với thời gian lƣu là 3,91 phút.
5/ Kết quả xác định một số chỉ tiêu vi sinh và hàm lƣợng một số kim loại nặng của sản phẩm muối canxihydroxycitrat tổng hợp đƣợc nằm trong khoảng cho phép.
Kiến nghị
1/ (-)-HCA có tính năng chống béo phì hiệu quả đƣợc cung cấp chủ yếu dƣới dạng các muối. Vì vậy, chúng ta nên tiếp tục nghiên cứu theo hƣớng điều chế và ứng dụng các muối của (-)-HCA ở dạng muối kép để tăng hiệu quả trong sản xuất dƣợc liệu hay thực phẩm chức năng với mục đích giảm cân.
2/ Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách (-)-HCA từ vỏ quả bứa theo quy mô công nghiệp để sản xuất thực phẩm giảm cân chứa (-)-HCA tại Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
[1]. Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn (2003), Đồ hộp- phương pháp xác định hàm lượng axit tổng số và axit bay hơi, Quyết định số 76/2003/QĐ-BNN.
[2]. Bộ Y Tế (1998), Danh mục Tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực, thực phẩm, Quyết định số 867/1998/QĐ-BYT.
3. Hoàng Minh Châu, Từ Văn Mặc, Từ Vọng Nghi (2002), Cơ sở Hoá học phân tích, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
[4]. Võ Văn Chi (1999), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản y học, Hà Nội.
[5]. Lê Văn Đăng (2005), Chuyên đề một số hợp chất thiên nhiên, Nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, thành phố Hồ Chí Minh. [6]. Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất
bản y học Hà Nội.
7. Hồ Viết Quý (1998), Các phương pháp phân tích hiện đại và ứng dụng trong hoá học, Nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
[8]. Đặng Quang Vinh (2007), Nghiên cứu chiết tách và xác định axit hydroxy citric trong lá, vỏ quả của cây bứa, Luận văn thạc sĩ khoa học hoá hữu cơ, Khoa hoá, Đại học Đà Nẵng.
Tiếng Anh
9. BhabaniS.Jena, Guddadarangavvanahally, Jayaprakasha, Kunnumpurath K. Sakariah (2002), "Organic Acids from Leaves, Fruits, and Rinds of Garcinia cowa", Journal of Agricultural and Food chemistry, 50(12), 3431- 3434.
[10]. Gokaraju et al. (2005), “New double salts of (-)-hydroxycitric acid and a process for preparing the same”, International Application Published under The Patent Cooperation Treaty (PCT), WO 2005/099679 A1.
[11]. Gokaraju et al. (2007), “Triple mineral salts of (-)-hydroxycitric acid and processes for preparing the same”, United States Patent US 7,208,615 B2.
12. Jayaprakasha, K. Sakariah, K. K (1998), “Determination of organic acids in Garcinia cambogia (Desr.) by HPLC”, Journal of Chromatography A, 806(2), 337-339.
[13]. Karanam Balasubramanyam, Bhaskaran Chandrasekhar, Candadai Seshadri Ramadoss, Pillarisetti Venkata Subba Rao (2000), “Soluble double metal salt of group ia and iia of (-) hydroxycitric acid, process of preparing the same and its use in beverages and other food products without effecting their flavor and properties”, United States Patent US
6,160,172.
14. Lowenstein, J. M. (1971), “Effect of (-)-hydroxyxitrat on fatty acid synthesis by rat liver inViVo”, The Journal of Biological Chemistby, 246(3), 629-632.
[15]. Muhammed Majeed, Vladimir Badmaev, Ramaswamy Rajendran (2004), “Process for the production of potassium hydroxy citric acid, and compositions containing the potassium hydroxy citric acid”, United States Patent US 6,770,782 B1.
[16]. Samuel et al. (2007), “Hydroxycitric acid complex metal salts, composition, and methods”, United States Patent US 7, 214,823 B2. [17]. Shrivastava et al. (2001), “Magnesium (-)hydroxycitrate, method of
preparation, applications, and compositions in particular pharmaceutical containing same”, United States Patent US 6,221,901 B1.
[18]. Soni MG, Burdock GA, Preuss HG, Stohs SJ, Ohia SE, Bagchi D. (2004), “Safety assessment of (-)-hydroxycitric acid and Super CitriMax, a novel calcium/potasium salt”, Food and Chemical Toxicology, 42(9), 1513-1529.
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tác giả luận văn
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ... i
MỤC LỤC ... ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ... vi DANG MỤC CÁC BẢNG ... vii DANH MỤC CÁC HÌNH ... viii MỞ ĐẦU ... 1 1. Lý do chọn đề tài ... 3 2. Mục đích nghiên cứu ... 4
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ... 4
3.1. Đối tƣợng nghiên cứu: ... 4
3.2. Phạm vi nghiên cứu: ... 5
4. Phƣơng pháp nghiên cứu... 5
4.1. Nghiên cứu lý thuyết: ... 5
4.2. Phƣơng pháp thực nghiệm: ... 5
5. Ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của đề tài ... 5
6. Cấu trúc của luận văn ... 6
CHƢƠNG 1 . TỔNG QUAN ... 6 1.1. CÂY BỨA ... 6 1.1.1. Bộ chè ... 6 1.1.1.1. Họ Chè (Theaceae) ... 6 1.1.1.2. Họ Măng cụt (Clusiaceae) ... 7 1.1.2. Bứa ... 7
1.1.3. Phân loại bứa ... 9
1.1.3.1. Bứa mọi ... 9
1.1.3.2. Bứa mủ vàng ... 10
1.1.3.4. Garcinia cowa Roxb ... 13
1.1.3.5. Garcinia cambogia ... 14
1.1.3.7. Garcinia atro Viridis ... 16
1.1.3.8. Garcinia dulcis ... 17
1.1.3.9. Garcinia hombroniana ... 17
1.1.3.10. Garcinia echinocarpa ... 18
1.1.4. Dẫn xuất của HCA ... 18
1.1.4.1. Hoá học của (-)-HCA ... 19
1.1.4.2. Muối của HCA ... 25
1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP KĨ THUẬT ... 31
1.2.1. Các phƣơng pháp phân huỷ mẫu phân tích ... 31
1.2.2. Phƣơng pháp trọng lƣợng ... 31
1.2.2.1. Xác định độ ẩm của nguyên liệu ... 31
1.2.2.2. Xác định hàm lƣợng tro của nguyên liệu ... 32
1.2.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ... 32
1.2.4. Phƣơng pháp chuẩn độ axit- bazơ ... 34
1.2.5. Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) ... 34
1.2.6. Phƣơng pháp chƣng ninh ... 36
1.2.7. Phƣơng pháp phân tích vi sinh vật ... 36
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 37
2.1. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ - HÓA CHẤT ... 37
2.2. SƠ ĐỒ QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM ... 39
2.3. NGUYÊN LIỆU ... 39
2.3.1. Cây bứa ... 39
2.3.2. Thu nguyên liệu ... 40
2.3.3. Xử lý nguyên liệu ... 41
2.4. Xác định một số tính chất vật lý ... 42
2.4.1. Xác định độ ẩm ... 42
2.4.2. Xác định hàm lƣợng tro ... 43
2.4.4. Chuẩn độ tổng lƣợng axit thu đƣợc bằng phƣơng pháp chuẩn độ axit- bazơ ... 44
2.4.5. Chƣng ninh bằng nồi áp suất để thu dịch chiết axit ... 44
2.4.6. Xác định hàm lƣợng HCA trong mẫu bằng phƣơng pháp HPLC ... 46
2.4.7. Tổng hợp muối canxi hydroxycitrat của HCA ... 48
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 48
3.1. MỘT SỐ TÍNH CHẤT VẬT LÝ CỦA NGUYÊN LIỆU ... 48
3.1.1. Độ ẩm của nguyên liệu ... 48
3.1.2. Hàm lƣợng tro ... 49
3.1.3. Xác định thành phần kim loại bằng phƣơng pháp AAS ... 49
3.1.4. Xác định tổng lƣợng axit trong mẫu chiết bằng phƣơng pháp chuẩn độ... 50
3.2. Xác định HCA trong mẫu chiết bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ... 51
3.2.1. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn ... 52
3.2.2. Kết quả xác định axit hữu cơ trong vỏ quả Bứa ... 52
3.3.TỔNG HỢP MUỐI CANXI CỦA HCA ... 56
3.3.1 Quy trình ... 56
3.3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến quá trình chuyển hoá tạo muối Canxi của HCA ... 56
3.3.3. Khảo sát theo thể tích ... 58
3.3.4. Khảo sát theo thời gian ... 59
3.3.5. Kiểm tra sản phẩm muối HCCa bằng phổ hồng ngoại (IR) ... 61
3.3.6. Kiểm tra sản phẩm muối HCCa bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ... 64
3.5. Tinh chế muối ... 65
3.6. Kiểm tra hàm lƣợng canxi trong sản phẩm muối HCCa... 71
3.7. Kiểm tra các chỉ tiêu Vi sinh vật trong sản phẩm muối HCCa. ... 71
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ... 71
TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 74 QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ (BẢN SAO)
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AAS : Atomic Absorption Spectrometric
HPLC : High Performance Liquid Chromatography IR : Infrared spectroscopy
DANH MỤC CÁC BẢNG
Số hiệu bảng Tên bảng Trang
1.1 Mô tả các đặc điểm của HCA 20
3.1 Kết quả xác định độ ẩm trong vỏ quả bứa sấy khô 50 3.2 Kết quả xác định tỉ lệ tro trong vỏ quả bứa sấy khô 50 3.3 Kết quả xác định hàm lƣợng một số kim loại trong vỏ
bứa
51 3.4 Kết quả xác định tổng lƣợng axit trong vỏ quả Bứa 52 3.5 Kết quả xác định axit hữu cơ trong vỏ quả Bứa bằng
HPLC
55 3.6 Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của khối lƣợng muối thu
đƣợc vào pH 58
3.7 Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của khối lƣợng muối thu đƣợc vào thể tích axit
60 3.8. Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của khối lƣợng muối thu
đƣợc vào thời gian khuấy trộn
61 3.9 Kết quả diện tích pic của phổ HPLC của sản phẩm muối
HCCa
71 3.10 Kết quả hàm lƣợng canxi trong muối HCCa bằng AAS 71 3.11 Kết quả xác định một số chỉ tiêu vi sinh của muối
canxi hydroxycitrat.
DANH MỤC CÁC HÌNH
Số hiệu hình Tên hình Trang
1.1 Quả, lá, hoa và cây bứa ở Quảng Ngãi 6
1.2 Cây bứa mọi ở Quảng Ngãi 8
1.3 Hoa, lá, quả của cây bứa mủ vàng 9
1.4 Cây bứa nhà ở Quảng Ngãi 10
1.5 Quả tai chua ở Quảng Ngãi 12
1.6 Lá, quả Garcinia cambogia 13
1.7 Cây, quả Garcinia Indica và Kokam 14 1.8 Hoa, lá, quả và cây Garcinia atroViridis 15
1.9 Quả Garcinia dulcis 16
1.10 Quả Garcinia hombroniana 16
1.11 Lá, hoa của Garcinia echinocarpa 17 1.12 Cấu trúc đồng phân của axit hiđroxi xitric 19 1.13 Cấu trúc của axit hiđroxi xitric lacton 19 1.14 Cấu thức thông thƣờng các muối một kim loại 25 1.15 Công thức thông thƣờng muối cặp kim loại nhóm IA
và IIA
26 1.16 Công thức thông thƣờng muối cặp kim loại nhóm II 27 1.17 Công thức thông thƣờng muối ba kim loại 28
2.1 Tủ sấy và lò nung 38
2.2 Hoá chất CaCl2 và NaOH 38
2.3 Cây và quả bứa ở Quảng Ngãi 40
2.4 Quả bứa ở Quảng Ngãi 41
2.6 Mẫu vỏ quả bứa khô cắt nhỏ 42 2.7 Mẫu vỏ quả bứa khô dạng bột mịn 42 2.8 Dịch chiết chƣa tẩy màu 46 2.9 Dịch chiết đã tẩy màu 46
2.10 Dịch chiết sau khi cô đặc 46