3.4.2.1. Xác định hàm lượng chất béo bằng phương pháp Soxhlet Nguyên tắc
Dựa vào tính chất hòa tan của các chất béo vào dung môi hữu cơ, chất béo được chiết ra khỏi mẫu phân tích bằng thiết bị chiết Soxhlet. Quá trình trích ly xảy ra liên tục có sự tuần hoàn dung môi. Khi dung môi hòa tan trong chất béo tạo hệ mixen tách hút hệ mixen ra.
- Tủ sấy - Cốc thủy tinh - Nồi cách thủy - Mặt kính đồng hồ
- Bình hút ẩm - Ete petro hoặc ete etylic (dung môi) - Cân phân tích - Bộ chiết Soxhlet
- Giấy lọc, bông
Tiến hành
Cân khoảng 5g mẫu phân tích đã được nghiền nhỏ vào ống giấy lọc (ống giấy lọc phải thấp hơn ống xiphong của máy chiết), gói kín ống giấy lọc và có lót bông ở hai đầu. Sau đó cho vào tháp trích ly. Lắp bình cầu đã được sấy khô và cân bằng cân phân tích để biết trọng lượng vào thiết bị cùng với ống sinh hàn. Qua cổ ống sinh hàn rót dung môi vào bình cầu, khoảng 2/3 dung tích bình cầu hoặc 2 lần dung tích tháp trích ly. Cho nước trả liên tục vào ống làm lạnh. Dùng nồi cách thủy đun bình cầu sao cho dung môi có nhiệt độ khoảng 40 – 60℃. Để tránh tổn thất dung môi, dung môi trong bình cầu không được sôi mạnh, đảm bảo sao cho cứ sau 1 giờ có 8 – 10 lần dung dịch mixen qua ống xiphong chảy xuống bình cầu.
Thời gian trích ly tùy thuộc vào hàm lượng chất béo có trong mẫu phân tích (6-10 giờ). Muốn biết quá trình chiết đã kết thúc hay chưa, lấy túi giấy lọc ra cho nhỏ vài giọt vào tấm kính đồng hồ hoặc tờ giấy lọc, khi dung môi bay hơi hết, trên mặt kính hoặc mặt giấy lọc không có vết chất béo thì quá trình chiết đã kết thúc. Sau quá trình chiết kết thúc, bỏ túi giấy lọc ra rồi tiến hành cất ete ngay trong tháp để thu hồi ete (trường hợp nếu dung dịch trong bình cầu đục, có lẫn bột nghiền thì phải lọc qua giấy lọc rồi mới cất thu hồi dung môi). Sau đó đem sấy khô chất béo ở nhiệt độ 100 - 105℃ đến trọng lượng không đổi. Lần sấy đầu sau 1 giờ thì cân, các lần sau cứ sau nửa giờ.
Tính kết quả
Hàm lượng chất béo tính theo công thức: X% = 𝐺1−𝐺2
𝐺 𝑥 100
Trong đó:
𝐺2 - Trọng lượng bình cầu không, g; G – Lượng mẫu phân tích, g;
3.4.2.2. Phân tích protein bằng phương pháp Kjeldahl Nguyên tắc
Nitơ có trong thành phần axit amin của protein là nitơ protein. Nitơ không có trong thành phần protein như của các muối vô cơ, axit nitric, các axit amin tự do, các peptit, ure và các dẫn xuất của ure, các ancaloit, các bazơ purin và pyrimiđin... là nitơ phi protein v.v...
Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein
Trước tiên mẫu được vô cơ hoá bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác. Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau:
2H2SO4 -> 2 H2O + 2 SO2 + O2
Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3.
2 NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4
Các nguyên tố P , Ca, Mg... chuyển thành dạng oxit: P2O5, KgO, CaO, MgO... Đuổi amoniac ra khỏi dung dịch bằng NaOH:
(NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + HgO + 2 NH3
NH3 bay ra cùng nước sang bình hứng, bình hứng chứa H2SO4
2 NH4OH + H2SO4 -> (NH4)2SO4 + 2 H2O
Tiến hành
a) Vô cơ hóa nguyên liệu
1. Cân 1g mẫu tươi hoặc 0,1 - 0,3g mẫu khô đã được nghiền nhỏ (dùng một ông giấy cân cuộn tròn). Cho cẩn thận vào đáy bìnhh Kjeldahl dung tích 50ml.
2. Cho thêm 5 – 10ml H2SO4 đặc (d=l,84). Nếu mẫu là bột khô, trước khi cho thêm axit cần cho vài giọt nước cất không có nitơ để thấm ướt bột. Nếu mẫu lỏng như nước mắm, xì dầu,... dùng pipelt lấy 2 - 5ml, còn nước quả hộp lấy 10 - 20ml. Khi cho mẫu vào bình, không được để mẫu dính bám cổ bình.
3. Đậy bằng nút lỏng thuỷ tinh quả hổng hoặc nút thuỷ tinh lọ nhỏ giọt. Lắc nhẹ bình rồi đặt lên bếp cách cát đun nhẹ khoảng 30 - 40 phút, sau đó nhấc bình ra, để nguội.
4 . Cho vài giọt xúc tác axit percloric (hoặc HClO3 hoặc H2O2 30%, chỉ cho ở giai đoạn cuối dung dịch đã có màu vàng sẫm) hoặc hỗn hợp K2SO4 và CuSO4 với tỉ lệ 3:1, cho một lần ngay từ đầu (lượng hỗn hợp chất xúc tác bằng lượng mẫu tươi dùng để vô cơ hóa), tiếp tục đốt trên bếp khoảng 30 phút nữa. Dung dịch sẽ chuyển từ màu đen sang màu cánh gián. Nhắc bình ra khỏi bếp, để nguội.
5. Cho thêm chất xúc tác lần thứ hai (vài giọt axit percloric), tiếp tục đốt cho đến khi dung dịch trong bình không màu. Để nguội.
6.Chuyển dung dịch sang bình định mức 50 hoặc 100 ml, tráng bình Kjeldahl vài lần bằng nước cất không có nitơ và dẫn đến thể tích định mức bằng nước cất không có nitơ. b) Sử dụng H2SO4 ở bình hứng • Hóa chất - H2SO4 đặc - Dung dịch H2SO4 (hoặc HCl) 0,1N (chính xác) - Dung dịch NaOH 30% - 40% - Dung dịch NaOH 0,1N.
- Thuốc thử hỗn hợp: metyl đỏ 0,1% trong rượu etylic và metyl xanh 0,1% trong rượu etylic, tỉ lệ 2:1.
- Chất xúc tác ( như trên)
-Thuốc thử Nessler: phát hiện sự có mặt nitơ trong dung dịch. Cách pha chế: + Cách 1: 15g HgI2; 10g KI hoà vào 15ml nước cất, thêm 80ml dung dịch NaOH 50%, dẫn thể tích đến 500ml bằng nưốc cất (không có nitđ và cacbonic).
+ Cách 2:
- 35g KI hòa tan trong 100 ml nưốc cất nóng - 17g HgCl2 hòa tan trong 300ml nước cất - NaOH hoặc KOH 20%
Đổ dung dịch HgCl2 vào dung dịch KI đến khi kết tủa đỏ của HgI2 tạo thành không thấy tan nữa thì dừng lại. Sau đó dùng dung dịch kiềm 20% dẫn đến 1 lít. Lại thêm 5ml dung dịch HgCl2 đến khi có kết tủa đỏ xuất hiện. Để dung dịch lắng đến khi hoàn toàn trong. Bảo quản trong lọ màu, đậy bằng nút cao su.
• Tiến hành:
Quá trình định lượng được tiến hành như trên nhưng ở bình hứng cho một lượng H2SO4 0,1N (sao cho ngập đầu ống làm lạnh) và vài giọt thuốc thử hỗn hợp. Theo dõi bình hứng, nếu thấy dung dịch biến đổi từ màu vàng sang màu lá mạ thì cho thêm 5ml H2SO4 0,lN nữa vào bình hứng, cần làm nhanh để tránh mất nitơ.
Đun sôi khoảng 30 phút, quan sát cột nước ở đầu ống làm lạnh không chuyển từ màu hồng sang xanh là được. Muốn chắc chắn, lấy nước đầu ống làm lạnh thử vói thuốc thử Nessler, lấy bìmh hứng ra và chuẩn độ axit dư bằng kiềm 0 ,1N.
• Tính kết quả:
Hàm lượng nitơ có trong mẫu được tính theo công thức: Nmg% = (V1−V2)x 1,42 x f x100
w
Trong đó:
V1 - số ml H2SO4 0,1N cho vào bình hứng,
V2 – số ml NaOH dùng để chuẩn độ axit dư trong bình hứng,
f - hệ số điều chỉnh nồng độ H2SO4 ở bình hứng, f = 1 khi nồng độ H2SO4
chính xác 0,1N,
w – khối lượng mẫu dùng để vô cđ hoá mẫu ứng vối thể tích dung dịch mẫu lấy để định lượng nitơ tương ứng với 1ml H2SO4,
1,42 – số mg nitơ.
* Chú ý:
- Quá trình vô cơ hoá mẫu trong bình Kjeldahl giải phóng khí SO2 nên phải tiến hành trong tủ hút.
- Thời gian đốt mẫu kéo dài 3 - 4 giờ phụ thuộc vào lượng mẫu, nguồn nhiệt và chất xúc tác. Nếu dùng CuSO4 với lượng lớn (1 - 2g) thì thời gian vô cơ hoá mẫu khoảng 2 - 3,5 giờ. Khi dùng H2O2 (4 - 5ml) mất 40 - 50 phút. Dùng selen (0,1 g/lg
mẫu thực vật) thời gian khoảng 30 - 40 phút. Dùng hỗn hợp xúc tác K2SO4: CuSO4 : Se (100:10:1) vói tỉ lệ 4 g/1g mẫu, thời gian khoảng 50 - 60 phút.
3.4.2.3. Xác định hàm lượng glucid theo phương pháp TCVN 4594:1988.
Tiến hành
+ Chuẩn bị dịch mẫu: cân 25g mẫu rồi thêm vào đó một lượng nước nóng, để nguội rồi định mức lên 250ml. Sau đó đem ly tâm tách tinh bột, định mức lượng tinh bột thu được lên 100ml, thêm vào 10ml acid HCl 15% và đun nóng ở 70 - 80℃ trong 30 phút. Để nguội, trung hòa bằng NaOH 10% và định mức lên 250ml. Ta thu được dịch tinh bột.
+ Lấy 20ml dung dịch Fericianua 1% và 5ml KOH 2,5N và thêm vài giọt xanh metylen, lắc đều, đun sôi trong 1 – 2 phút. Sau đó, dùng dung dịch mẫu ở trên chuẩn độ cho đến khi màu xanh của xanh metylen chuyển sang tím hồng, cuối cùng là màu vàng rơm thì kết thúc.
Tính kết quả
Hàm lượng glucid (%) = (a.k.0,5)/V x 100 Trong đó:
a: Lượng glucoza tương ứng, a = 0,0215; k: Hệ số pha loãng, k = 25;
V: Số ml dịch mẫu tiêu hao khi chuẩn độ (ml); 0,9: Hệ số chuyển đổi đường thành glucid.
3.4.2.4. Xác định hàm lượng đường tổng số bằng phương pháp Bertrand
Đây là phương pháp được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và cho tới nay vẫn được xem là chính xác so với các phương pháp khác.
Dùng dung dịch Fehling A và B (bao gồm CuSO4 và tartrat kép trong môi trường kiềm) khử đường khử có trong dung dịch phân tích để tạo thành đồng oxit kết tủa màu đỏ.
Dụng cụ
- Bình tam giác. - Ống đong.
Hóa chất
- Dung dịch Fehling A: cân 40g CuSO4. 5H2O, hòa tan và định mức tới lít sau đó đêm lọc rồi cho vào lọ nút nhám khô rồi đậy kín.
- Dung dịch Fehling B: cân 200g muối tartrat kép và 150g NaOH vào 2 cốc khác nhau, sau đó đêm hòa tan lẫn và để nguội rồi định mức tới 1 lít. Đem lọc rồi bảo quản trong bình nâu nút kín.
- Dung dịch Fe2(SO4)3: cân 50g Fe2(SO4)3 hòatan trong 500 – 600 ml nước. Tiếp đó cho thêm 110 ml H2SO4 đậm đặc (d = 1,84) rồi đổ đầy tới 1 lít. Sau khi lọc ra thêm vài giọt KMnO4 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt rồi bảo quản trong bình kín.
- Dung dịch KMnO4 0,1N.
Tiến hành
- Dùng ống đong lấy 20ml Fehling A và 20ml Fehling B cho vào bình tam giác rồi dùng pipet hút 20ml dung dịch đường đã xử lý và pha loãng vào. Lắc đều rồi đặt bình tam giác lên bếp điện hoặc bếp ga, đun sao cho sau 3 – 4 phút thì sôi và cho sôi tiếp đúng 3 phút nữa. Lấy bình ra khỏi bếp và để lắng, sau đó đem lọc qua phễu xốp rồi rửa nhiều lần bằng nước cất nóng 70 - 80℃.
3.4.2.5. Xác định chỉ số calo trong bánh
% năng lượng của bánh thành phẩm được tính toán như sau:
+ Giá trị năng lượng của bánh được tính theo hệ số: 1g protein cho 4Kcal, 1g lipid cho 9 Kcal, 1g glucid cho 4 Kcal.
+ Giá trị năng lượng trong bánh (Kcal) = giá trị năng lượng cung cấp của protein, lipid, glucid cộng lại.
+ % năng lượng của protein trong bánh = giá trị năng lượng cung cấp của protein/giá trị năng lượng cung cấp trong thực phẩm x 100.
+ % năng lượng của lipid và glucid trong thực phẩm: tính tương tự như % năng lượng cung cấp của protein.
3.4.2.6. Xác định độ ẩm của bánh
Độ ẩm trong nguyên liệu thường được xác định theo phương pháp sấy nhưng chỉ cho kết quả gần đúng. Vì khi sấy ở nhiệt độ cao, một số chất hữa cơ của nguyên liệu sẽ bị phân hủy và bay hơi cùng với nước, khi đó lại có một lượng nhỏ nước liên kết không bay hơi hết. Để hạn chế sai số người ta chỉ sấy ở 100 - 105℃ và kéo dài 3 – 4 giờ. Đôi khi muốn rút ngắn thời gian sấy người ta thực hiện ở 130℃ trong 40 phút.
Dụng cụ
- Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ 105 - 150℃. - Cân phân tích có độ chính xác 0,001g. - Hộp cân.
- Bình hút ẩm.
Tiến hành
- Cân khoảng 5g bột đã nghiền nhỏ trong hộp nhôm đã biết trọng lượng. Mở nắp và đặt hộp nhôm vào tủ sấy có nhiệt độ 105℃, sau 3 giờ sấy đậy nắp và làm nguội trong bình hút ẩm, sau đó cân lại, ghi số cân. Sấy tiếp 30 – 60 phút. Sau đó đem làm nguội và cân lại lần 2. Nếu sai số giữa hai lần không quá 0,001g thì xem như quá trình tách nước kết thúc.
Kết quả
Độ ẩm của nguyên liệu (%) được tính theo công thức: W = m1− m2
m1 x 100, % (m/m) Trong đó:
m1 – khối lượng mẫu trước khi sấy, g;
m2 – Khối lượng mẫu sau khi sấy, g;
3.4.2.7. Phương pháp phân tích vi sinh vật tổng số
Nguyên tắc
Nuôi cấy một lượng mẫu nhất định hoặc mẫu đã pha loãng lên môi trường thạch dinh dưỡng ở nhiệt độ 30 ± 1℃ trong điều kiện hiếu khí, thời gian 48 – 72 giờ. Đếm tất cả số khuẩn lạc mọc trên đó. Từ tổng số khuẩn lạc đếm được sẽ suy ra số lượng tết bào sống có trong mẫu phân tích.
Chú ý: Cần chọn độ pha loãng thích hợp sao cho số khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa petri nằm trong khoảng 30 – 300.
Dụng cụ
- Dụng cụ chuẩn bị mẫu (thìa, cối xay, dao, kéo,…). - Hộp petri, ống nghiệm dùng để pha loãng mẫu. - Pipet 1 và 10ml.
Hóa chất, môi trường
- Môi trường TGA (Trypton Glucoza Agar): Trypton hoặc pepton 5g; glucoza 4g; cao nấm men 2,5g; thạch 15g; H2O cho đủ 1000ml. Môi trường hấp khử trùng ở nhiệt độ 121℃ trong thời gian 20 phút.
- Thạch màng: dung dịch nước thạch 1%
- Dung dịch pha loãng: nước cất hoặc nước muối sinh lý vô trùng (0,85% NaCl).
Tiến hành
- Rửa sạch và khử trùng các dụng cụ (hộp petri, pipet, ống nghiệm, các đồ chứa mẫu) cũng như các dịch pha loãng).
- Pha loãng thập phân mẫu phân tích với nồng độ thích hợp để dễ dàng cho việc quan sát đếm khuẩn lạc. Thời gian thao tác không quá 30 phút.
- Cấy giống trên bề mặt thạch:
+ Môi trường sau khi đã hấp khử trùng thì rót vào các đĩa petri, mỗi đĩa cho 15 – 18ml môi trường. Xếp các đĩa trên mặt phẳng ngang, để yên cho đến khi thạch nguội và đông hoán toàn (có thể để 2 – 3 ngày ở nhiệt độ 30℃ để kiểm tra độ vô trùng của các hộp). Khi cấy chọn các hộp petri còn hoàn toàn vô trùng.
- Lấy 0,05 ml (hay 1 giọt) mẫu đã pha loãng cho vào hộp petri (mỗi độ pha loãng nên làm đồng thời 2 – 3 hộp và nên làm hai cấp pha loãng liên tiếp nhau) đã chứa môi trường thạch dinh dưỡng, trang đều trên mặt thạch.
- Lật ngược đĩa, đặt vào tủ ấm để nhiệt độ 30 ± 1℃ trong thời gian 24 – 72 giờ.
Sau khi khuẩn lạc đã mọc, đếm số lượng các khuẩn lạc mọc trên các đĩa có số lượng nằm trong khoảng 30 – 300. Nếu ngay ở đĩa cấy mẫu nguyên chất (lỏng) hoặc dung dịch huyền phù gốc mà có số lượng ít hơn 30 khuẩn lạc thì vẫn lấy kết quả đó.
Số lượng vi sinh vật trung bình có trong 1 ml hay 1g mẫu được tính theo công thức:
N (khuẩn lạc/g hay khuẩn lạc/ml) = ∑ C
(n1+0,1n2).f1.v
Trong đó:
∑ C - tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa;
n1 – số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1 (độ pha loãng thấp nhất);
n2 – số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2 (độ pha loãng tiếp theo); f1 – hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ 1;
v – thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa petri.
3.4.2.8. Phân tích nấm men và nấm mốc
Nguyên tắc
Môi trường dinh dưỡng phải chứa chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn (chất kháng sinh như Oxytetracyclin hoặc Chloramphenicol).
Cấy lên bề mặt thạch của môi trường Yeast Glucose Chloramphenicol một lượng mẫu đã được pha loãng nhất định và nuôi ở nhiệt độ 30 ± 1℃ trong điều kiện hiếu khí, thời gian 48 – 72 giờ. Đếm tất cả số khuẩn lạc mọc trên đó từ đấy suy ra