Coli của CuO và Cu2O

Các hạt nano CuO và nano Cu2O có cơ chế kháng vi sinh vật được mô tả trong hình 1.3. Các hạt nano này xâm nhập qua thành tế bào của vi sinh vật và tương tác với các cấu trúc nội bào nhờ kích thước hạt nhỏ với năng lượng và diện tích bề mặt lớn. Hoạt tính kháng khuẩn của nano Cu phụ thuộc vào kích thước hạt, ngoài ra nó còn phụ thuộc vào nồng độ hạt và nhiệt độ. Khi kích thước hạt nhỏ, nồng độ hạt và nhiệt độ cao sẽ hạn chế sự kết tụ của các hạt nano làm tăng diện tích bề mặt giúp tương tác tốt với màng tế bào từ đó làm tăng độc tính đối với vi khuẩn [7].

1.2.5. Độc tính của nano Cu và nano Cu2O

Các muối Cu từ thời cổ đại đã được sử dụng làm thuốc trị nấm cho cây trồng. Cho đến nay, các muối và hợp chất của Cu vẫn tỏ ra có hiệu quả trong việc phòng trừ bệnh thực vật. Tại Việt Nam, các sản phẩm thuốc BVTV gốc Cu thường ở dạng hỗn hợp các muối vô cơ như CuSO4 và vôi Ca(OH)2 (hỗn hợp Bordeaux), CuOCl, CuCl, Cu(CH3COO)2 và CuCl2Cu(OH)3. Cho đến nay, các nghiên cứu đều xác nhận muối Cu ít độc với động vật máu nóng, không ảnh hưởng xấu đến cây trồng, ít tích lũy trong đất và nông sản. Sản phẩm thuốc BVTV sử dụng hợp chất của Cu có phổ phòng trừ nấm bệnh rộng, phòng trừ được nhiều loại bệnh trên cây trồng do vi khuẩn và vi nấm gây ra. Tuy nhiên

một số sản phẩm thuốc BVTV chứa Cu có những hạn chế nhất định như thuốc khi hoà tan trong môi trường kiềm hoặc các thuốc khác có tính kiềm, phân bón chứa anion PO43-,... thì chúng bị giảm hoạt tính. Nồng độ sử dụng của các muối Cu trong phòng trừ bệnh thực vật tương đối cao từ 0,1 – 0,2% nên có thể để lại dư lượng trên nông sản.

Độ độc của nano Cu và các hợp chất nano Cu trên động vật máu nóng nhỏ hơn của các muối Cu2+. Các kết quả nghiên cứu về độc tính của các hợp chất nano Cu trên cơ thể động vật hiện nay được công bố còn tương đối ít vì chúng là loại vật liệu mới [51]. Chen và cộng sự (2006) đã xác định được liều lượng gây chết 50% (LD50) của ion Cu, nano Cu qua đường miệng trên chuột tương ứng là 119 mg/kg và 413 mg/kg, kết quả cho thấy nano Cu ít độc hơn ion Cu2+ (CuCl2) [8]. Lee và cộng sự (2016) đã xác định độc tính cấp LD50 của nano Cu và ion Cu (CuCl2) qua đường miệng trên thỏ, kết quả nghiên cứu cho thấy thử nghiệm trên thỏ đực thì giá trị LD50 của nano Cu là 1.344 mg/kg cao hơn 2,1 lần so với ion Cu là 640 mg/kg. Thử nghiệm trên thỏ cái cho thấy giá trị LD50 của nano Cu là 2.411 mg/kg cao hơn 4,2 lần so với ion Cu là 571 mg/kg

[7].Nano Cu2O, Cu2O/zeolite có độc tính cấp thấp hơn ion Cu [52]. Như vậy, các hạt nano Cu, nano Cu2O cũng giống như nano Ag, nano CuO và nano ZnO có độc tính thấp hơn so với các muối kim loại của chúng, đặc biệt đối với động vật giáp xác, cá trong nghiên cứu của Bondarenko và cộng sự (2013) [5]. Như vậy, sử dụng vật liệu nano trong nông nghiệp an toàn hơn so với sử dụng muối kim loại kể cả trong môi trường nước, thủy sản.

Khi ở ngoài môi trường, dưới tác động của oxy và nước, các hạt nano Cu, CuO, Cu2O dễ dàng chuyển thành Cu2+ làm dinh dưỡng vi lượng cho cây trồng. Vì vậy, vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate có độ an toàn cao khi sử dụng trong nông nghiệp.

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong những năm vừa qua, ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu tổng hợp và định hướng sử dụng các hợp chất của nano kim loại Cu làm thuốc BVTV vì chúng có hiệu quả ức chế vi sinh vật gây bệnh thực vật cao trên một số loại cây trồng và tương đối an toàn. Đến nay, việc sử dụng các hợp chất nano kim

loại Cu trong phòng trừ bệnh cho cây trồng chưa được thương mại hóa vì các công bố mới ở trong giai đoạn thử nghiệm.

Một số nghiên cứu về tổng hợp nano Cu định hướng ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp đã được công bố bao gồm: Nguyễn Hoài Châu và cộng sự (2014) đã thử nghiệm sử dụng nano Cu để xử lý hạt giống ngô nhằm kích thích sinh trưởng, tăng năng suất và tăng khả năng chống chịu cho cây ngô, đã làm tăng trưởng chiều cao cây ngô vượt trội hơn đối chứng 10 cm và tăng năng suất hơn 33% so với hạt ngô không qua xử lý nano Cu [53]. Năm 2014, Cao Văn Dư và cộng sự cũng đã nghiên cứu chế tạo nano Cu bằng phương pháp sử dụng chất khử hydrazin để khử Cu2+ trong chất ổn định glycerin/ Polyvinylpyrrolidone (PVP) và thử nghiệm hiệu ứng kháng bệnh nấm hồng trên cây cao su, xác nhận vật liệu có hiệu quả trong việc kháng nấm

Corticium salmonicolor [54].

Sử dụng hạt nano kim loại để kháng vi khuẩn gây bệnh trên cây trồng đã được nghiên cứu bởi tác giả Nguyễn Thị Thu Thủy (2018) khi nghiên cứu sử dụng nano đồng-bạc/silica để ức chế vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá lúa. Trong thí nghiệm in vitro, vật liệu nano đồng-bạc/silica ở nồng độ

70 ppm và 100 ppm đạt 100% hiệu lực ức chế vi khuẩn sau 2 ngày nuôi cấy. Trong thí nghiệm nhà lưới, nano đồng-bạc/silica với nồng độ 100 ppm đã làm giảm tỷ lệ bệnh bạc lá lúa từ 87,22% xuống còn 5,56%, giảm chỉ số bệnh bạc lá lúa từ 56,35% xuống còn 0,58%, hiệu quả tương đương với thuốc thương mại Kasumin 2L [55]. Bùi Duy Du và cộng sự (2017) đã nghiên cứu tổng hợp vật liệu nano Cu2O/zeolite A dạng bột, vật liệu này có hiệu lực phòng trừ 99,99% vi khuẩn E. coli tại nồng độ Cu là 15 ppm [52]. Vật liệu dạng dung dịch keo nano CuCl ổn định trong chitosan có hiệu lực phòng trừ các bệnh trên cây trồng ở mức độ cao như bệnh đạo ôn lúa (91%), đốm nâu thanh long (78%), bệnh chết chậm trên hồ tiêu (68%) trong thí nghiệm ngoài đồng ruộng đã được công bố bởi nhóm tác giả Bùi Duy Du (2017) [56]. Ngoài khả năng kháng lại vi sinh vật, một số loại nano Cu còn có khả năng kháng tuyến trùng rễ, ví dụ vật liệu nano CuCl/zeolite 4A dạng bột có hiệu lực phòng trừ tuyến trùng rễ gây bệnh trên cây cà phê ở nồng độ Cu 20 ppm đạt gần 100% [57]. Trong số các vật liệu nêu trên, nano CuCl có hiệu quả phòng trừ nấm bệnh cao nhưng chúng chứa ion Cl- trong dung dịch là một yếu tố gây nên tình trạng cháy lá khi

thời tiết nắng nóng, làm sượng trái trên cây có múi như cam, bưởi, quýt, sầu riêng, mít,... Để khắc nhược điểm này, thay vì sử dụng tiền chất CuCl phản ứng với chất khử hydrazin để tạo ra nano CuCl, trong nghiên cứu của luận văn này sẽ sử dụng CuSO4 tác dụng với chất khử trong môi trường kiềm để tạo ra vật liệu nano Cu2O-Cu ổn định trong alginate, vật liệu không chứa Cl- là giải pháp khắc phục được tác hại của Cl- nêu trên. Việc tạo ra nano Cu2O-Cu xảy ra ở môi trường kiềm, vì vậy sử dụng polyme alginate làm chất ổn định là phù hợp vì chúng là chất điều hòa sinh trưởng thực vật, tương hợp sinh học, tan và bền trong môi trường kiềm. Trong nghiên cứu của Bùi Duy Du và cộng sự (2019) và Đoàn Thị Bích Ngọc và cộng sự (2020) đã báo cáo rằng vật liệu nano Cu2O- Cu/alginate với hàm lượng Cu 30 ppm đã ức chế hoàn toàn nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu thanh long và vi khuẩn Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn lúa trong thí nghiệm in vitro [58,59].

Mặc dù vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate đã được công bố có hiệu quả trong việc ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long và nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn trên cây lúa nhưng chưa có các nghiên cứu hiệu lực kháng trên đối tượng vi khuẩn gây hại thực vật, cụ thể là vi khuẩn Xanthomanas sp. gây bệnh bạc lá trên cây lúa. Vì vậy, kết quả nghiên cứu hiệu ứng kháng của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate đối với vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa trong luận văn này là những nghiên cứu mới chưa từng được công bố.

1.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Để kiểm soát vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh bạc lá trên lúa đã có nhiều nghiên cứu và biện pháp được áp dụng.

Phương pháp sử dụng biện pháp sinh học được nghiên cứu bởi Pustika (2020), tác giả sử dụng chế phẩm vi sinh vật đối kháng gồm Azotobacter chroococum, Azotobacter vinelandii, Azospirillum sp., Pseudomonas cepacia,

Penicillium sp. và Acinetobacter với mật độ trên 107 Cfu/g phun lên lúa đã làm giảm chỉ số bệnh bạc lá xuống mức thấp 14,44% so với nghiệm thức không xử lý 17,5% sau 10 tuần gieo cấy [60]. Phương pháp xử lý hạt giống được Nagendran và cộng sự (2013) báo cáo các lô lúa thí nghiệm xử lý ngâm hạt giống lúa với Endophytes có chỉ số bệnh bạc lá lúa thấp hơn đáng kể (2,8%) so

với lô lúa đối chứng không xử lý (19,82%) khi gieo trồng trong điều kiện nhà lưới [61].

Đối với biện pháp sử dụng hóa chất tổng hợp, Ibrahim và cộng sự (2019) đã sử dụng vi khuẩn Endophytes (các chủng vi sinh vật nội sinh thực vật) để tổng hợp các hạt nano Ag có kích thước 25 – 50 nm, kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae khi sử dụng vật liệu ở nồng độ 20 µg/mL cho thấy đường kính vòng vô khuẩn là 17,3 mm trong thí nghiệm đục lỗ thạch [62]. Li và cộng sự (2014) đã nghiên cứu in vitro sử dụng các dẫn xuất 2,5-substituted-1,3,4-oxadiazole/thiadiazole

sulfone có tác dụng ức chế vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae và

Xanthomonas oryzae pv. oryzicolaby via gây bệnh bạc lá lúa hiệu quả với

EC50 là 1,07 µg/mL. Hoạt chất này thể hiện khả năng khoáng khuẩn trong điều kiện nhà lưới đạt hiệu quả phòng trừ bệnh bạc lá lúa khoảng 63% với nồng độ sử dụng là 200 µg/mL tại thời điểm 15 ngày sau xử lý [63].

Gần đây, các loại vật liệu nano đã được nghiên cứu để kiểm soát bệnh bạc lá lúa. Sherkhane và cộng sự (2018) đã tổng nano Ag bằng dịch chiết lá cây Tulsi, khi sử dụng vật liệu ở nồng độ 15 mM để kháng vi khuẩn

Xanthomonas axonopodis pv. punicae theo phương pháp đục lỗ thạch cho

thấy đường kính vòng vô khuẩn là 22 mm lớn hơn so với đối chứng sử dụng AgNO3 là 12 mm [64].

Nano Cu2O có hiệu lực kháng khuẩn cao, tương đương với nano CuO và nano Cu [30,51]. Trong thời gian vừa qua, nhiều nghiên cứu sử dụng các hợp chất nano Cu nhằm quản lý các loài vi sinh vật gây hại trên một số cây trồng đã được công bố bao gồm: Huang và cộng sự (2015) đã báo cáo rằng nồng độ nano CuO trong khoảng 500 – 750 mg/kg có khả năng ức chế nấm A. solani gây bệnh đốm vòng trên cây cà chua, đạt hiệu lực ức chế từ 70,7 – 81,7%. Kết quả này cho thấy CuO có hiệu lực cao hơn so với đối chứng sử dụng carbendazim 50% [65]. Liao và cộng sự (2019) công bố nano Cu ở nồng độ

100 µg/mL có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn Xanthomonas perforans gây bệnh đốm vi khuẩn trên cây cà chua trong thí nghiệm in vitro

[66].

Nhận xét:

Qua nghiên cứu tổng quan tài liệu, có thể thấy rằng bệnh bạc lá trên lúa do vi khuẩn Xanthomonas sp. là bệnh xuất hiện thường xuyên, gây ảnh hưởng lớn đến năng suất trong canh tác lúa ở Việt Nam. Có nhiều biện pháp để quản lý bệnh bạc lá lúa, trong đó việc sử dụng thuốc BVTV được xem là biện pháp phòng trừ phổ biến được nông dân lựa chọn để giảm thiểu thiệt hại do loại bệnh này gây ra. Hiện nay, tình trạng lạm dụng thuốc BVTV tổng hợp hữu cơ có thể phát sinh vi sinh vật kháng thuốc và ảnh hưởng đến sức khỏe của người sản xuất, đồng thời để lại dư lượng trên nông sản gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng.

Ngày nay, công nghệ nano được biết đến là một trong những phương pháp tạo ra vật liệu mới có thể kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh thực vật. Phương pháp tổng hợp các hạt nano Cu2O-Cu từ muối Cu2+ trong polyme bảo vệ, sử dụng chất khử để tạo ra dung dịch keo nano là một công nghệ đơn giản, chi phí thấp và có thể phát triển với quy mô lớn. Cho đến nay, các tác giả mới chỉ nghiên cứu điều chế các dung dịch keo nano Cu với nồng độ Cu thấp từ 0,01-10 mM nên ít có giá trị thực tiễn [30]. Trong các chất khử hóa học để khử Cu2+, hydrazin được báo cáo là một tác nhân khử hiệu quả so với axit ascorbic và glucose do phản ứng xảy ra ở nhiệt độ thường không phải gia nhiệt và tạo ra các hạt có kích thước nhỏ và đồng đều hơn [67]. Các hạt nano có diện tích bề mặt lớn và năng lượng bề mặt cao nên lực hấp dẫn giữa chúng rất lớn, nhanh chóng va chạm xảy ra kết tụ và phá hủy hệ keo nano. Vì lý do đó, cần thiết phải tạo ra lớp bảo vệ giữa các hạt nano bằng cách sử dụng chất hoạt động bề mặt, các chất đóng nắp có cấu trúc mao quản hoặc các polyme như alginate. Alginate phù hợp với quy trình điều chế nano Cu2O-Cu vì chúng tương hợp sinh học với Cu, tan và bền trong môi trường kiềm, ngoài ra chúng còn có khả năng chống oxy hóa và ngăn cản oxy xâm nhập vào dung dịch, giúp tạo ra các hạt nano Cu bền không bị oxy hóa. Tổng hợp các kiến thức trên, trong nghiên cứu của luận văn này chúng tôi sử dụng tiền chất là CuSO4 tạo phức với dung dịch NH3 và phân tán trong dung dịch alginate Khánh Hòa, sử dụng chất khử hydrazin để phản ứng với dung dịch trên tạo thành vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate có độ bền cao, định hướng ứng dụng làm chất kiểm soát vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh bạc lá trên lúa. Ngoài khả năng kháng vi khuẩn, vi nấm do có kích

thước nhỏ, năng lượng bề mặt lớn, vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate còn là dinh dưỡng giúp tăng trưởng cây trồng nên chúng không để lại dư lượng trên nông sản. Như vây, vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate là chất kiểm soát bệnh thực vật an toàn, đồng thời là loại phân bón vi lượng hiệu quả cao. Công nghệ tổng hợp vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate sử dụng hóa chất thông dụng có giá thấp, thiết bị đơn giản nên tạo ra sản phẩm có giá thành hợp lý rất có tiềm năng thay thế các loại thuốc BVTV hữu cơ độc hại.

Gần đây, đã có một vài công trình nghiên cứu sử dụng các hạt nano Cu và Cu2O làm chất kiểm soát vi sinh vật gây hại cây trồng [34,34]. Tuy nhiên, các nghiên cứu này chỉ đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của các hạt nano này trong thí nghiệm in vitro thực hiện trên đĩa thạch nên tác động của chúng với vi sinh vật ngoài môi trường chưa được đánh giá.

Các nghiên cứu trong luận văn này thực hiện một cách hệ thống nghiên cứu hoạt tính kháng vi khuẩn Xanthomonas sp. ở điều kiện in vitro trong thí nghiệm đĩa thạch, dựa vào kết quả này, thực hiện xác định hiệu lực phòng trừ bệnh bạc lá trên lúa trong điều kiện nhà lưới nhằm có các kết quả khoa học tương đối chính xác về khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa trong điều kiện gần với điều kiện xử lý vật liệu ngoài đồng ruộng.

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Vi khuẩn Xanthomonas sp. được cung cấp bởi Bộ môn Bảo vệ thực vật – Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam.

Alginate chiết xuất từ rong nâu Khánh Hòa (có khối lượng phân tử ~ 51.200 g/mol) được cung cấp bởi Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng.