Kích thước hạt nano Cu2O-Cu/alginate được xác định bằng phần mềm Photoshop CS6 và được thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2016.
Tất cả các số liệu thử nghiệm in vitro và in vivo được xử lý thống kê và phân tích phương sai bằng phần mềm Microsoft Excel 2016 và phần mềm IRRISTAT 5.0 để so sánh sự sai khác có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình của các số liệu thực nghiệm. Số liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TỔNG HỢP VẬT LIỆU NANO Cu2O-Cu/ALGINATE
Vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate được tổng hợp bằng phương pháp khử hóa học phức [Cu(NH3)4]SO4 hình thành từ CuSO4.5H2O và dung dịch NH3 theo phản ứng (3.1), hydrazin sử dụng làm chất khử và alginate làm chất ổn định, pH tối ưu cho phản ứng khử Cu2+ là pH > 11 [67].
Hình 3.1. Thay đổi màu sắc dung dịch trong quá trình khử Cu2+
Trong quá trình khử Cu2+ thành Cu+ và hình thành các hạt Cu2O-Cu có kích thước nano ổn định trong alginate, màu sắc dung dịch thay đổi từ màu xanh sang màu nâu đỏ đặc trưng của dung dịch keo nano. Phản ứng khử muối Cu2+ thành Cu2O được mô tả theo phương trình phản ứng sau [30]:
Cu2+ + 4NH4OH → [Cu(NH3)4]2+ + 4H2O
4[Cu(NH3)4]2+ + N2H4 + 16OH- + alginate → 2Cu2O/alginate + N2 + 16NH3 + 6H2O + 8OH-
2Cu2O/alginate + N2H4 → 4Cu°/alginate + N2 + 2H2O Cu2O/alginate + Cu°/alginate → Cu2O-Cu/alginate
3.1.1. Kết quả xác định kích thước và sự phân bố kích thước hạt của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate
Hình thái và sự phân bố kích thước của các hạt nano Cu2O-Cu ổn định trong alginate được thể hiện trong ảnh TEM hình 3.2. Hạt nano có hình cầu, với độ phân tách tốt và phân bố trong phạm vi hẹp từ 2 – 10 nm, kích thước hạt
trung bình là 5,3 ± 2,5 nm. Hàm lượng Cu trong vật liệu nano Cu2O- Cu/alginate được xác định bằng phương pháp ICP-MS là 5,087 mg/L. Kết quả này cho thấy alginate là chất ổn định thích hợp để tổng hợp hạt nano Cu2O-Cu với kích thước nhỏ khoảng 5 nm và nồng độ Cu cao tới 5.000 ppm.
Hàm lượng Cu của vật liệu nano được tổng hợp trong luận văn này cao hơn gấp hàng trăm lần so với các nghiên cứu của các tác giả trước đây: Yang và cộng sự (2015) điều chế nano Cu2O@Cu ổn định trong PVP với nồng độ Cu từ 0,13 – 0,20 mM thu được các hạt nano Cu2O có kích thước khoảng 55 nm, các hạt nano Cu2O@Cu có lõi giả định là 55 nm, vỏ Cu từ 15 – 30 nm [73]. Nhóm tác giả Giannousi và cộng sự (2014) tổng hợp được dung dịch keo Cu có nồng độ 0,15 mM với kích thước hạt Cu2O khoảng 30 nm, hạt Cu/CuO khoảng 7 nm, hạt Cu/Cu2O khoảng 170 nm [30]. Vì vậy, việc nghiên cứu điều chế vật liệu nano composite Cu2O-Cu/alginate với nồng độ cao trong khảo sát của luận văn này không những có ý nghĩa khoa học mà còn có tiềm năng ứng dụng vật liệu trong đời sống.
Hình 3.2. Ảnh chụp TEM (a) và sự phân bố kích thước hạt nano Cu2O- Cu/alginate (b)
3.1.2. Nghiên cứu cấu trúc tinh thể của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate Cu/alginate
Giản đồ XRD của alginate chiết suất từ rong nâu và nano Cu2O- Cu/alginate được thể hiện trong hình 3.3.
Hình 3.3. Giản đồ XRD của alginate (a) và nano Cu2O-Cu/alginate (b)
Giản đồ XRD của alginate ở hình 3.3a cho thấy, alginate được chiết xuất từ rong nâu Khánh Hòa xuất hiện 2 đỉnh đặc trưng của alginate ở 2θ ~13,4° và 21.6°, ngoài ra còn xuất hiệu các đỉnh ở mức 2θ ~28,2°; 29,3°; 31,9°; 32,4° và 34,2°, chứng tỏ rằng alginate có cấu trúc tinh thể. Những vị trí nhiễu xạ khác có thể alginate chiết xuất từ rong biển còn chứa một số khoáng chất và hợp chất hữu cơ có trong rong biển. Vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate được nghiên cứu sử dụng trong nông nghiệp nên không cần thiết phải tinh sạch alginate bởi vì các khoáng chất và hợp chất hữu cơ như axit amin, protein là chất dinh dưỡng cho cây trồng.
Giản đồ XRD của nano Cu2O-Cu/alginate ở hình 3.3b thể hiện các đỉnh đặc trưng của Cu2O và Cu, chứng tỏ các ion Cu2+ đã bị khử thành Cu° và Cu+. Sáu đỉnh ở vị trí 2θ ~29,6°; 36,4°; 42,4°; 61,5°; 73,6°; 77,5° tương ứng với các mặt phẳng (110), (111), (200), (220), (311) và (222) của dữ liệu tiêu chuẩn cho cấu trúc tinh thể lập phương tâm mặt của Cu2O. Đồng thời trong giản đồ XRD hình 3.3b cũng cho thấy các đỉnh đặc trưng của Cu° ở các vị trí có góc 2θ ~43,4° (111); 50,6° (200); 74,3° (220), các các đỉnh này cho thấy kim loại Cu có cấu trúc tinh thể lập phương. Các đỉnh này phù hợp với các đỉnh được đưa ra bởi dữ liệu JCPDS phổ XRD cho Cu2O (JCPDS: 34-1354) và Cu° (JCPDS: 04-0836) và phù hợp với các nghiên cứu về Cu2O của Badawy và cộng sự (2015) [74].
Kích thước hạt Cu2O và Cu trong vật liệu Cu2O-Cu/alginate được xác định bằng phương trình Scherrer [35] từ giản đồ XRD (hình 3.3b) lần lượt ở vị
trí 2θ ~36,3° và 2θ ~43,5° là 5,6 và 6,3 nm trình bày trong bảng 3.1. Kích thước hạt nano Cu2O-Cu tính theo phương trình này lớn hơn kích thước hạt trung bình của chúng khi đo bằng phương pháp đo TEM. Có thể các hạt Cu2O-Cu đã bị kết tụ khi chúng ở dạng bột trong quá trình đo XRD [75].
Bảng 3.1. Kích thước hạt nano Cu2O và Cu tính qua phổ XRD
Hạt
Cu2O Cu
3.1.3. Phổ FT-IR của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate
Dữ liệu phổ hồng ngoại của alginate và nano Cu2O-Cu/alginate được biểu diễn trong hình 3.4.
Hình 3.4. Phổ FT-IR của alginate chiết xuất rong nâu (a) và nano Cu2O- Cu/alginate (b)
Phổ FT-IR hình 3.4a cho thấy sự hiện diện của axit mannuronic, các liên kết hydro (O–H) và (C–H) ở vị trí số sóng lần lượt là 830 cm-1, 3468 cm-1 và 2928 cm-1 tương ứng trong alginate. Hai đỉnh hấp thụ mạnh được quan sát thấy ở vị trí số sóng 1.610 cm-1 và 1.415 cm-1 được cho là dao động không đối xứng và đối xứng của các nhóm carboxylate (O–C–O) tương tự như nghiên cứu của tác giả Khajouei và cộng sự (2018) [76]. Đỉnh hấp thụ ở vị trí số sóng 1.128
cm-1 là đặc trưng của dao động C-O kéo dài trong vòng pyranose của alginate. Phổ FT-IR hình 3.4b cho thấy sự thay đổi từ vị trí số sóng 3.459 đến 3.428 cm-
1 đó là do alginate ổn định các hạt nano Cu2O-Cu. Sự giảm tần số này có thể xảy ra do sự tương tác phối trí của Cu° với các nhóm –OH [77]. Mặt khác, dải
liên kết tập trung ở số sóng 618 cm-1 đặc trưng cho Cu2O và được gán cho dao động của Cu-O trong phân tử Cu2O [28]. Khi xảy ra sự ổn định, xuất hiện dải tương ứng với dao động của –C–O–ở vị trí số sóng thấp hơn từ 1.128 đến 1.111 cm-1 [77]. Từ dữ liệu phổ FI-IR nêu trên đã xác nhận sự hình thành của nano Cu2O-Cu trong dung dịch keo. Như vậy các hạt nano Cu2O-Cu được ổn định trong alginate có thể là do liên kết phối trí giữa Cu° với nhóm C=O, O–C–O và
–OH của alginate như nghiên cứu của Visurraga và cộng sự (2012) trong nghiên cứu điều chế nano Cu bảo vệ bằng alginate [77].
3.1.4. Phổ UV-vis của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate
Phổ UV-vis của phức hợp alginate/Cu2+ và nano Cu2O-Cu/alginate được biểu diễn trong hình 3.5.
Hình 3.5. Phổ UV-vis của alginate/phức Cu2+ (a) và nano Cu2O-Cu/alginate (b)
Hình 3.5a cho thấy, xuất hiện một đỉnh hấp thụ của alginate/Cu2+ ở bước sóng 234 nm đặc trưng cho alginate. Theo các nghiên cứu trước đây, dải hấp thụ cực đại đặc trưng cho các hạt nano Cu nằm trong phạm vi từ 550 – 600 nm và của các hạt nano Cu2O nằm trong phạm vi từ 300 – 500 nm [78]. Phổ UV-vis của mẫu nano Cu2O-Cu/alginate được trình bày trong hình 3.5b cho thấy
chỉ xuất hiện đỉnh hấp thụ đặc trưng của các hạt nano Cu trong dung dịch ở khoảng bước sóng từ 605 – 610 nm, không quan sát thấy đỉnh hấp thụ cực đại đặc trưng cho Cu2O nằm trong khoảng bước sóng từ 300 – 500 nm. Theo tác giả Yang và cộng sự (2015), hiện tượng này có thể giải thích như sau: Các hạt nano Cu2O bao bọc bên ngoài bị chất khử tiếp tục khử Cu+ thành Cu° hình thành cấu trúc vỏ Cu và lõi Cu2O (Cu@Cu2O core-shell) [73].
Giản đồ XRD của mẫu Cu2O-Cu/alginate (hình 3.3) cho thấy chúng gồm 2 thành phần là Cu2O và Cu do có các đỉnh đặc trưng của 2 nguyên tố này. Dựa trên kết quả nhiễu xạ tia X và phổ UV-vis có thể kết luận, do dư chất khử N2H4, ion Cu+ bị khử thành Cu° theo phương trình 3.4 [73].
Khi lớp vỏ Cu2O bị khử thành Cu° sẽ tạo thành các hạt nano có lớp vỏ Cu° và lõi là Cu2O, cơ chế tạo cấu trúc lõi-vỏ được mô tả ở hình sau:
Hình 3.6. Sơ đồ mô phỏng mô phỏng phản ứng tạo cấu trúc nano lõi-vỏ Cu2O@Cu [73]
Điểm mới và khác biệt của quá trình tổng hợp hạt nano Cu2O@Cu của luận văn này so với phương pháp của Yang là quá trình khử Cu2+ với chất khử N2H4 chỉ cần một giai đoạn. Quy trình của Yang sử dụng chất khử axit ascorbic để khử Cu2+ và ổn định trong PVP thu được dung dịch keo nano Cu2O, giai đoạn 2 thêm dung dịch Cu2+ vào dung dịch nano Cu2O và tiếp tục khử Cu2+ thành Cu° bám lên bề mặt hạt Cu2O với sự hỗ trợ của nhiệt độ tạo thành các hạt Cu2O@Cu. Phát hiện mới của luận văn là tổng hợp hạt nano cấu trúc Cu2O@Cu trong chất bảo vệ alginate cần thiết sử dụng lượng chất khử N2H4 dư tính theo phương trình khử Cu2+ thành Cu2O, lúc này quá trình khử sẽ khử liên tục trong một công đoạn.
3.1.5. Độc tính của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate
3.1.5.1. Độc tính cấp đường miệng
Chuột sau khi cho uống chất thử được theo dõi thường xuyên để kịp thời ghi nhận những biểu hiện bất thường. Kết quả thử nghiệm độc tính qua đường miệng trên chuột của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate được trình bày trong bảng 3.2.
Kết quả cho thấy, sau 15 ngày uống chất thử không ghi nhận có cá thể chuột chết ở cả hai nhóm chứng âm và nhóm thử nghiệm với liều thử nghiệm là 300 mg/kg và 3.000 mg/kg thể trọng. Các cá thể chuột ở cả hai nhóm chứng âm và nhóm thử nghiệm không bị xù lông, khả năng vận động như nhau, mắt sáng, không bị mờ đục. Về hành vi, các cá thể chuột ở cả hai nhóm thử nghiệm và nhóm chứng âm không có biểu hiện bất thường về sinh lý như gãi ngứa, mệt mỏi, bỏ ăn. Chuột đi ngoài phân khô, màu sắc phân của các cá thể chuột ở nhóm thử nghiệm được ghi nhận hoàn toàn bình thường tương tự như các dấu hiệu của chuột ở nhóm chứng âm.
Bảng 3.2. Độc tính cấp LD50 qua đường miệng trên chuột của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate
Nhóm
Chứng âm Thử nghiệm Thử nghiệm
LD50 độc tính cấp đường miệng của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate trong thí nghiệm trên chuột lớn hơn 3.000 mg/kg do không có chuột nào chết trong thời gian theo dõi.
3.1.5.2. Độc tính qua tiếp xúc da
Chuột sau khi bôi dung dịch chất thử sẽ được theo dõi thường xuyên để kịp thời ghi nhận những biểu hiện bất thường. Phản ứng nhạy cảm da trên chuột được quan sát và ghi lại trong 24 giờ và 48 giờ sau khi thử thách. Kết quả điều
tra tỷ lệ nhạy cảm tiếp xúc qua da thí nghiệm trên chuột được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Tỷ lệ nhạy cảm da của chuột với vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate
Không quan sát thấy ban đỏ, phù nề hoặc các thay đổi khác trên da ở nhóm chứng âm và nhóm thử sau 3 lần phơi nhiễm và 1 lần thử thách, tỷ lệ nhạy cảm là 0%. Nhóm chứng dương có hiện tượng ban đỏ và tỷ lệ nhạy cảm là 100% (xem chi tiết ở phụ lục 2). Ở nhóm chứng âm, các cá thể chuột hoàn toàn không có các biểu hiện bất thường về sinh lý.
Hình 3.7. Các cá thể chuột ở nhóm thử nghiệm sau 48 giờ bôi dung dịch nano Cu2O-Cu/alginate
Các cá thể chuột ở nhóm thử nghiệm sau 7 ngày quan sát, tại vị trí được bôi chất thử không có hiểu hiện lở loét, hay sưng tấy. Khả năng ăn, uống của chuột bình thường, không xuất hiện các biểu hiện bất thường về sinh lý như chán ăn hay mệt mỏi, các vùng lông trên cơ thể không bị rụng, không bị xù, mắt chuột sáng, không mờ đục.
Nhận xét:
Vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate tổng hợp từ tiến chất muối CuSO4.5H2O được khử bởi tác nhân hydrazin và ổn định trong alginate chiết xuất từ rong biển nâu ở dạng dung dịch keo với hàm lượng Cu là 5.087 ppm. Các hạt nano Cu2O- Cu có hình cầu, phân bố trong phạm vi hẹp từ 2 – 10 nm, kích thước trung bình là 5,3 ± 2,5 nm. Vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate có phổ UV-vis thể hiện đỉnh hấp thụ đặc trưng của nano Cu, phổ FT-IR và giản đồ XRD cho thấy chúng gồm hai thành phần là Cu2O và Cu°. Dựa trên các công trình công bố trước đây của Yang và cộng sự (2014) và Visurraga và cộng sự (2012) [73,77], luận văn đưa ra giả thuyết các hạt nano có cấu trúc lõi-vỏ Cu2O@Cu và ổn định trong alginate bằng liên kết phối trí giữa Cu° với nhóm chức C=O, O–C–O và
–OH được điều chế theo phương pháp khử một công đoạn. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với các nghiên cứu về tổng hợp nano Cu2O-Cu/alginate của Bùi Duy Du và cộng sự (2019) và Đoàn Thị Bích Ngọc và cộng sự (2020) [58,59].
Vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate không gây nhạy cảm da (liều lượng gây nhạy cảm > 5.000 mg/kg) và có độc tính qua đường miệng LD50 > 3.000 mg/kg trong thí nghiệm trên chuột, do đó độc tính của vật liệu thuộc nhóm IV (cẩn thận) theo phân loại độc tính thuốc BVTV.
3.2. HOẠT TÍNH KHÁNG VI KHUẨN XANTHOMONAS SP. GÂY BỆNHBẠC LÁ TRÊN LÚA CỦA VẬT LIỆU Cu2O-Cu/ALGINATE BẠC LÁ TRÊN LÚA CỦA VẬT LIỆU Cu2O-Cu/ALGINATE
3.2.1. Nghiên cứu hiệu lực ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. của vậtliệu nano Cu2O-Cu/alginate trong thí nghiệm in vitro liệu nano Cu2O-Cu/alginate trong thí nghiệm in vitro
Vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate được sử dụng để nghiên cứu hoạt tính kháng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh bạc lá trên cây lúa trong thí nghiệm in vitro. Kết quả được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Hiệu lực ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. của vật liệu nano Cu2O- Cu/alginate Nghiệm thức Đối chứng LSD0,05 CV (%)
Ghi chú: Trong cùng 1 cột các giá trị có các chữ cái a, b theo sau chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)
Từ kết quả trình bày ở bảng 3.4 cho thấy sau 24 giờ nuôi cấy, mật độ khuẩn lạc ở các nghiệm thức bổ sung nano Cu2O-Cu/alginate dao động từ 0 – 7,27×103 Cfu/mL. Mật độ khuẩn lạc ở hai nghiệm thức bổ sung nano Cu2O- Cu/alginate với nồng độ Cu 15 ppm và 22,5 ppm lần lượt là 1,47×103 và 7,27×103 Cfu/mL. Nghiệm thức bổ sung nano Cu2O-Cu/alginate ở nồng độ Cu
30ppm có hiệu lực ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. đạt 100% và tương đương với nghiệm thức bổ sung thuốc thương mại Xantocin 40WP (250 ppm broponol) sau 24 giờ nuôi cấy.
Các nghiên cứu sử dụng một số loại hạt nano kim loại làm chất kiểm soát sự phát triển của vi khuẩn Xanthomonas sp. đã được nhiều tác giả công bố. Nguyễn Thị Thu Thủy và cộng sự (2018) công bố nano đồng-bạc/silica đạt 100% hiệu lực ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. ở nồng độ 50 ppm sau 48 giờ nuôi cấy