Phương pháp khối phổ plasma cảm ứng (ICP-MS)

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.6. Phương pháp khối phổ plasma cảm ứng (ICP-MS)

Phương pháp ICP-MS là một kỹ thuật phân tích dùng để xác định nồng độ đa nguyên tố và đồng vị trong các mẫu chất lỏng, rắn hoặc khí. Nó kết hợp nguồn plasma argon tạo ion với giới hạn phát hiện nhạy cảm của phát hiện khối phổ.

Với kích thước mẫu nhỏ, phải đảm bảo rằng các mẫu được thu thập là đại diện cho vật liệu khối. Do ICP-MS có thể phát hiện các yếu tố ở nồng độ dưới dạng vài nanogram mỗi lít (phần nghìn tỷ), cần phải cẩn thận trong việc thu thập và lưu trữ mẫu trước khi đo. Nên hạn chế sử dụng các dụng cụ thủy do các tạp chất bị rò rỉ từ thủy tinh hoặc sự hấp thụ chất phân tích bằng thủy tinh. Nếu sử dụng thủy tinh, cần được rửa định kỳ bằng chất oxy hóa mạnh như axit cromic (H2Cr2O7) hoặc chất tẩy thủy tinh thương mại. Vật chứa mẫu sử dụng nhựa PTFE hoặc Teflon. Tất cả các vật chứa, pipet, đầu pipet nên được ngâm trong HNO3 từ 1 – 2%.

Mẫu ở dạng rắn phải được nghiền thành bột mịn với cối và chày sứ sau đó rây qua lưới. Mẫu đầu tiên nên được loại bỏ để tránh nhiễm bẩn từ vữa hoặc rây. Phá mẫu bột sau rây bằng axit đậm đặc siêu tinh khiết hoặc các tác nhân oxy hóa như axit chloric (HClO3) và pha loãng theo đúng thứ tự cường độ với HNO3 từ 1 – 2%.

Mẫu ở dạng khí cũng có thể được phân tích bằng cách tiêm trực tiếp vào dụng cụ. Ngoài ra, thiết bị sắc ký khí có thể được ghép nối với máy ICP- MS để tách nhiều khí trước khi đưa vào mẫu.

Mẫu ở dạng lỏng hoặc dung dịch, các mẫu phải được pha loãng với HClO3 siêu tinh khiết 1 – 2% đến nồng độ thấp để tạo ra cường độ tín hiệu thấp hơn. Sau khi pha loãng, mẫu phải được lọc qua màng 0,25 – 0,45 μm để loại bỏ các hạt.

Mẫu phân tích được đưa vào đuốc plasma ICP dưới dạng sol khí bằng cách hút mẫu vào ống phun. Mẫu sẽ bị đề solvat và các nguyên tố trong sol khí sẽ được chuyển thành các nguyên tử khí rồi được ion hóa tại phần cuối của đuốc plasma. Nguồn ICP chuyển các nguyên tử của nguyên tố trong mẫu thành các ion. Sau đó, những ion này được phân tách và phát hiện bằng thiết bị khối phổ.

Tiến hành: Vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate được đo và phân tích hàm lượng Cu trên máy Perkin Elmer NexION 2000 – Mỹ tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng.

2.2.7. Đánh giá độ độc của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate

Chuột nhắt trắng giống Swiss được cung cấp bởi Viện Pasteur TP.HCM có trọng lượng từ 18 – 22 g. Chuột được nuôi ở điều kiện 25°C, ẩm độ phòng nuôi 65 – 72% với nguồn thức ăn tiêu chuẩn được cung cấp từ Viện Pasteur TP.HCM có bổ sung giá sống. Nước uống sạch được cung cấp đầy đủ qua bình nước chuyên dụng cho chuột. Thí nghiệm thử nghiệm độc tính cấp trên chuột trắng thực hiện tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường (Đại học Nông Lâm TP.HCM).

2.2.7.1. Xác định độc tính qua đường miệng trên chuột

Độc tính cấp đường miệng được xác định theo phương pháp hướng dẫn OECD cho các thử nghiệm về Hóa chất 423 – Độc tính cấp đường miệng 17/12/2001 [68].

Sau khi đưa về phòng thí nghiệm, chuột được nuôi ổn định trong 3 ngày, ngừng cung cấp thức ăn cho chuột một đêm trước khi tiến hành thử nghiệm. Cân và ghi nhận trọng lượng từng con, tiến hành ghi số thứ tự trên lưng chuột và cho vào hộp nuôi lớn (hình 2.2). Chuột được chăm sóc ở điều kiện nhiệt độ

25°C ± 3°C, độ ẩm tương đối 40% – 70%. Thử nghiệm được thực hiện trên 2 nhóm chuột gồm:

+ Nhóm chứng âm: 06 con chuột khỏe mạnh (3 con chuột đực và 3 con chuột cái)

+ Nhóm thử nghiệm: 06 con chuột khỏe mạnh (3 con chuột đực và 3 con chuột cái)

Liều thử nghiệm là 300 mg/kg và 3.000 mg/kg khối lượng cơ thể chuột. Vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate được pha loãng bằng nước cất để đạt nồng độ là 10 mg/mL và 100 mg/mL. Thể tích cho uống là 0,3 mL/10 g trọng lượng cơ thể chuột với nồng độ 10 mg/mL ở liều thử nghiệm 300 mg/kg và 0,3 mL/10g trọng lượng cơ thể chuột với nồng độ 100 mg/mL ở liều thử nghiệm 3.000 mg/kg.

Cho chuột uống chất thử bằng kim cong chuyên dụng (1 mL), theo dõi tỷ lệ chết ở chuột trong vòng 15 ngày sau khi uống chất thử. Tính liều LD50 theo phương pháp Behrens – Karber [69].

Hình 2.2. Chuột được nuôi trong hộp nhựa có gắn nắp lưới

2.2.7.2. Xác định kích ứng da (nhạy cảm da) trên chuột

Xác định kích ứng da trên chuột theo hướng dẫn OECD cho các thử nghiệm về Hóa chất 406 – Nhạy cảm da 17/7/1992 [70].

Sau khi được đưa về phòng thí nghiệm, chuột được nuôi ổn định trong 3 ngày, khoảng 24 giờ trước khi tiến hành thử nghiệm, cạo sạch lông ở vùng lưng của chuột, diện tích vùng cạo là 1 cm2 (hình 2.3). Chuột được chăm sóc ở điều

kiện nhiệt độ 25°C ± 3°C, độ ẩm tương đối 40% – 70%. Thử nghiệm được thực hiện trên 03 nhóm chuột gồm:

+ Nhóm chứng âm: gồm 06 con chuột khỏe mạnh (03 con chuột đực và 03 con chuột cái). Chất tiếp xúc gây nhạy cảm là nước cất, chất thử thách là nước cất.

+ Nhóm thử nghiệm: gồm 20 con chuột khỏe mạnh (10 con chuột đực và con chuột 10 cái). Chất tiếp xúc gây nhạy cảm là vật liệu nano Cu2O- Cu/alginate (dùng nguyên mẫu), chất thử thách là vật liệu nano Cu2O- Cu/alginate (dùng nguyên mẫu).

+ Nhóm chứng dương: gồm 06 con chuột khỏe mạnh (03 con chuột đực và 03 con chuột cái). Chất tiếp xúc gây nhạy cảm là 2,4-dinitrochlorobenzene với nồng độ 8 mg/mL, chất thử thách là 2,4-dinitrochlorobenzene với nồng độ là 4 mg/mL.

Bôi 2 g chất thử/kg trọng lượng cơ thể chuột lên vùng da đã cạo lông. Các thời điểm tiếp xúc gây nhạy cảm là ngày 0, ngày 7 và ngày 14. Thời điểm thử thách là ngày 28.

Theo dõi các biểu hiện phản ứng nhạy cảm da (ban đỏ, phù nền hoặc các thay đổi khác trên da) của chuột trong 24 giờ và 48 giờ sau khi thử thách và

đánh giá tỷ lệ nhạy cảm.

Hình 2.3. Chuột được đánh số thứ tự và ghi nhận trọng lượng ban đầu

2.2.8. Nghiên cứu hiệu lực ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. của vậtliệu nano Cu2O-Cu/alginate trong thí nghiệm in vitro liệu nano Cu2O-Cu/alginate trong thí nghiệm in vitro

Thí nghiệm nghiên cứu hiệu lực ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. in vitro

được tham khảo theo phương pháp của Nguyễn Thị Thu Thủy (2018) [55].

Vi khuẩn Xanthomonas sp. sau khi đưa về phòng thí nghiệm được bảo quản ở 4°C. Trước các thí nghiệm, cấy truyền vi khuẩn trên đĩa petri chứa 15 – 20 mL môi trường LB Agar (25 g LB, 16 g agar, 1.000 mL nước, hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút) để tạo khuẩn lạc đơn. Bước tiếp theo, cấy tăng sinh chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. bằng cách chuyển một phần khuẩn lạc đơn của vi khuẩn vào bình tam giác 250 mL chứa 200 mL môi trường LB Broth (25

gLB, 1.000 mL nước, hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút). Tiếp tục đưa bình tam giác chứa dịch vi khuẩn đem đi lắc tăng sinh ở 170 vòng/phút trong 24 giờ

[71]. Dung dịch tăng sinh vi khuẩn được pha loãng đến 10-6 lần, hút 0,1 mL dung dịch vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng nhỏ lên đĩa petri chứa môi trường LB Agar bổ sung nano Cu2O-Cu/alginate với các nồng độ Cu là 15 ppm; 22,5 ppm; 30 ppm và thuốc thương mại Xantocin 40WP với nồng độ broponol 250 ppm, sử dụng que cấy thủy tinh trang đều lên bề mặt môi trường rồi tiến hành nuôi cấy ở cùng điều kiện (28°C).

Thí nghiệm gồm 05 nghiệm thức được lặp lại 03 lần, mỗi nghiệm thức lặp lại trên 03 đĩa petri. Các nghiệm thức gồm:

NT1: Môi trường LB Agar

NT2: Môi trường LB Agar bổ sung nano Cu2O-Cu/alginate 15 ppm Cu NT3: Môi trường LB Agar bổ sung nano Cu2O-Cu/alginate 22,5 ppm Cu NT4: Môi trường LB Agar bổ sung nano Cu2O-Cu/alginate 30 ppm Cu NT5: Môi trường LB Agar bổ sung thuốc thương mại Xantocin 40WP 250 ppm broponol

Xác định mật độ vi khuẩn ở các nghiệm thức sau 24 giờ nuôi cấy bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, hiệu lực ức chế (HLUC) vi khuẩn được xác định như sau:

HLUC (100%) =C −Cc × 100 Trong đó:

C: Mật độ khuẩn lạc ở nghiệm thức đối chứng

c: Mật độ khuẩn lạc ở nghiệm thức bổ sung chất thử

2.2.9. Nghiên cứu hiệu lực phòng trừ bệnh bạc lá lúa của vật liệunano Cu2O-Cu/alginate trong thí nghiệm nhà lưới nano Cu2O-Cu/alginate trong thí nghiệm nhà lưới

Thí nghiệm đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh bạc lá lúa của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate trong điều kiện nhà lưới được tham khảo từ nghiên cứu của Đoàn Thị Bích Ngọc và cộng sự (2020) [59].

Thời gian: từ 18/04/2020 đến 25/07/2020.

Địa điểm nghiên cứu: Khu nhà lưới Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam – Số 121 Nguyễn Bỉnh Khiêm, quận 1, thành phố Hồ Chí Minh.

Giống lúa: Lúa nếp 46 (IR 4625).

Đất thịt được xử lý với vôi, sau đó cho vào các chậu nhựa với lượng đất bằng nhau, mỗi chậu gồm 7 kg đất thịt đã trộn với 4g phân bón NPK 16-16-8. Cấy 6 dảnh mạ giống lúa nếp IR 4625 trong các chậu nhựa có kích thước Ø 30×26,8 cm. Các chậu được đặt trong nhà lưới.

Phương pháp bón phân:

−Bón lần 1: Bón 3 g phân bón NPK 16-16-8 vào ngày thứ 10 sau cấy −Bón lần 2: Bón 3 g phân bón NPK 16-16-8 vào ngày thứ 20 sau cấy −Bón lần 3: Bón 3 g phân bón NPK 21-5-21 vào ngày thứ 5 trước khi trổ bông.

Cây lúa sau 35 ngày tuổi thì bắt đầu phun 20 mL dung dịch nano Cu2O- Cu/alginate ở các nồng độ Cu là 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm và thuốc thương mại Xantocin 40WP (250 ppm broponol) theo nồng độ khuyến cáo. Nghiệm thức đối chứng âm phun nước lã. Sau 24 giờ phun thuốc, tiến hành lây nhiễm nhân tạo bằng cách tạo vết thương trên lá (cắt đầu lá) rồi phun dung dịch vi khuẩn Xanthomonas sp. với mật độ 108 Cfu/mL, dung dịch vi khuẩn được phun ướt đều toàn bộ thân và lá cây lúa.

Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm (a) và chuẩn bị thuốc thử (b)

Thí nghiệm gồm 05 nghiệm thức được lặp lại 03 lần, mỗi nghiệm thức lặp lại trên 03 chậu. Các nghiệm thức gồm:

NT1: Phun nước lã

NT2: Phun dung dịch nano Cu2O-Cu/alginate (20 ppm Cu) NT3: Phun dung dịch nano Cu2O-Cu/alginate (30 ppm Cu) NT4: Phun dung dịch nano Cu2O-Cu/alginate (40 ppm Cu)

NT5: Phun thuốc thương mại Xantocin 40WP (250 ppm broponol)

Phương pháp điều tra bệnh hại: theo QCVN 01-166:2014/BNNPTNT

[72].Tiến hành thu thập số liệu tình trạng bệnh của cây lúa tại thời điểm sau 7 và 14 ngày lây nhiễm. Các chỉ tiêu theo dõi gồm:

- Tỷ lệ lúa nhiễm bệnh (TLB) được xác định theo công thức như sau: Số lá bị bệnh

TLB (%) =Tổng số lá điều tra× 100

- Chỉ số lá bệnh (CSB) được xác định theo công thức Townsend- Heuberger:

CSB (%) =9n9+7n7+ 5n5+3n3+ n1× 1009N

Trong đó:

N: Tổng số lá điều tra

n1: Số lá bị bệnh ở cấp 1 có diện tích bệnh < 1% n3: Số lá bị bệnh ở cấp 3 có diện tích bệnh 1 – 5%

n5: Số lá bị bệnh ở cấp 5 có diện tích bệnh > 5 – 25% n7: Số lá bị bệnh ở cấp 7 có diện tích bệnh > 25 – 50% n9: Số lá bị bệnh ở cấp 9 có diện tích bệnh ≥ 50%

− Hiệu lực phòng trừ (HLPT) của thuốc được tính theo công thức Abbott:

HLPT (%) = (1 – TaCa ) × 100 Trong đó :

Ta : Chỉ số bệnh ở nghiệm thức xử lý thuốc tại thời điều tra

Ca : Chỉ số bệnh ở nghiệm thức đối chứng âm tại thời điểm điều tra

Phương pháp đánh giá độc tính của thuốc đối với cây lúa (cấp độc): Theo thang phân 9 cấp độc tính như sau:

Bảng 2.1. Thang phân 9 cấp độc tính đối với cây trồng

Cấp độc 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Phương pháp điều tra năng suất lúa:

Lúa sẽ được thu hoạch tại thời điểm 30 ngày sau khi trổ bông, tỷ lệ tăng năng suất ở các nghiệm thức có xử lý thuốc được tính theo công thức sau:

Năng suất tăng (%) =m − m0 × 100

m0

Trong đó:

m: Năng suất lúa ở nghiệm thức có xử lý thuốc (g/chậu)

m0: Năng suất lúa ở nghiệm thức chứng âm (g/chậu)

2.2.10. Phương pháp xử lý số liệu

Kích thước hạt nano Cu2O-Cu/alginate được xác định bằng phần mềm Photoshop CS6 và được thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2016.

Tất cả các số liệu thử nghiệm in vitro và in vivo được xử lý thống kê và phân tích phương sai bằng phần mềm Microsoft Excel 2016 và phần mềm IRRISTAT 5.0 để so sánh sự sai khác có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình của các số liệu thực nghiệm. Số liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. TỔNG HỢP VẬT LIỆU NANO Cu2O-Cu/ALGINATE

Vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate được tổng hợp bằng phương pháp khử hóa học phức [Cu(NH3)4]SO4 hình thành từ CuSO4.5H2O và dung dịch NH3 theo phản ứng (3.1), hydrazin sử dụng làm chất khử và alginate làm chất ổn định, pH tối ưu cho phản ứng khử Cu2+ là pH > 11 [67].

Hình 3.1. Thay đổi màu sắc dung dịch trong quá trình khử Cu2+

Trong quá trình khử Cu2+ thành Cu+ và hình thành các hạt Cu2O-Cu có kích thước nano ổn định trong alginate, màu sắc dung dịch thay đổi từ màu xanh sang màu nâu đỏ đặc trưng của dung dịch keo nano. Phản ứng khử muối Cu2+ thành Cu2O được mô tả theo phương trình phản ứng sau [30]:

Cu2+ + 4NH4OH → [Cu(NH3)4]2+ + 4H2O

4[Cu(NH3)4]2+ + N2H4 + 16OH- + alginate → 2Cu2O/alginate + N2 + 16NH3 + 6H2O + 8OH-

2Cu2O/alginate + N2H4 → 4Cu°/alginate + N2 + 2H2O Cu2O/alginate + Cu°/alginate → Cu2O-Cu/alginate

3.1.1. Kết quả xác định kích thước và sự phân bố kích thước hạt của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate

Hình thái và sự phân bố kích thước của các hạt nano Cu2O-Cu ổn định trong alginate được thể hiện trong ảnh TEM hình 3.2. Hạt nano có hình cầu, với độ phân tách tốt và phân bố trong phạm vi hẹp từ 2 – 10 nm, kích thước hạt

trung bình là 5,3 ± 2,5 nm. Hàm lượng Cu trong vật liệu nano Cu2O- Cu/alginate được xác định bằng phương pháp ICP-MS là 5,087 mg/L. Kết quả này cho thấy alginate là chất ổn định thích hợp để tổng hợp hạt nano Cu2O-Cu với kích thước nhỏ khoảng 5 nm và nồng độ Cu cao tới 5.000 ppm.

Hàm lượng Cu của vật liệu nano được tổng hợp trong luận văn này cao hơn gấp hàng trăm lần so với các nghiên cứu của các tác giả trước đây: Yang và cộng sự (2015) điều chế nano Cu2O@Cu ổn định trong PVP với nồng độ Cu từ 0,13 – 0,20 mM thu được các hạt nano Cu2O có kích thước khoảng 55 nm, các hạt nano Cu2O@Cu có lõi giả định là 55 nm, vỏ Cu từ 15 – 30 nm [73]. Nhóm tác giả Giannousi và cộng sự (2014) tổng hợp được dung dịch keo Cu có nồng độ 0,15 mM với kích thước hạt Cu2O khoảng 30 nm, hạt Cu/CuO khoảng 7 nm, hạt Cu/Cu2O khoảng 170 nm [30]. Vì vậy, việc nghiên cứu điều chế vật liệu nano composite Cu2O-Cu/alginate với nồng độ cao trong khảo sát của luận văn này không những có ý nghĩa khoa học mà còn có tiềm năng ứng dụng vật liệu trong đời sống.

Hình 3.2. Ảnh chụp TEM (a) và sự phân bố kích thước hạt nano Cu2O- Cu/alginate (b)