Phƣơng pháp thử độ độc tế bào ung thƣ in vitro đƣợc Viện Ung thƣ Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thƣ (TBUT) ở điều kiện in vitro. Phép thử này đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp của
Monks (1991) [88]. Phép thử tiến hành xác định hàm lƣợng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo đƣợc khi thành phần protein của tế bào đƣợc nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo đƣợc tỉ lệ thuận
với lƣợng SRB gắn với phân tử protein, do đó lƣợng tế bào càng nhiều (lƣợng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn.
Phép thử đƣợc thực hiện trong điều kiện cụ thể nhƣ sau:
Pha các mẫu dịch chiết thử thành các dải nồng độ thích hợp. Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm. Chất thử (10 L) đã pha ở các nồng độ vào các giếng của đĩa 96 giếng, thêm 190 l tế bào đã điều chỉnh nồng độ phù hợp ở trên vào các giếng này sao cho nồng độ mẫu thử trong giếng là 100, 20, 4, và 0.8 g/mL đối với cặn chiết và nồng độ 100, 20, 4, và 0.8 M đối với chất sạch. Ủ trong tủ ấm 48 giờ. Giếng không có chất thử nhƣng có TBUT (190l) sẽ đƣợc sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ đƣợc cố định bằng Trichloracetic acid – TCA. Sau 48 giờ, tế bào đƣợc cố định bằng TCA trong 1 giờ, đƣợc nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 oC, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô ở nhiệt độ phòng. 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lƣợng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút. Đọc kết quả OD ở bƣớc sóng 515-540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad).
Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ đƣợc xác định thông qua công thức sau:
[OD(chất thử) - OD(ngày 0)] x 100 % Ức chế = 100% -
OD(đối chứng âm) - OD(ngày 0)
Phép thử đƣợc lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine ở các nồng độ 10
g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml đƣợc sử dụng nhƣ là chất đối chứng dƣơng; DMSO 10% luôn đƣợc sử dụng nhƣ đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ đƣợc xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.