phân đoạn
Hình 2.17: Bố trí thí nghiệm thu hồi IMO từ tinh bột khoai lang bằng phương pháp phân đoạn
(1) Ảnh hưởng của mức độ thủy phân đến hiệu quả tổng hợp IMO
Để đánh giá ảnh hưởng của quá trình thủy phân tinh bột trước khi đưa dịch vào giai đoạn gắn nhánh đến khả năng tổng hợp IMO, tiến hành tạo các dịch thủy phân có mức độ thủy phân (DE) khác nhau và thực hiện gắn nhánh các dung dịch đã chuẩn bị. Dịch tinh bột 25% (w/v) được thủy phân bằng α- amylase (1,0 CU/g) và β-amylase (8 U/g) trong các khoảng thời gian khác nhau. Dịch sau thủy phân sau đó được đem gắn nhánh bằng enzyme transglucosidase nồng độ 15 U/g trong điều kiện nhiệt độ 50°C, pH 5,0 trong thời gian 12 giờ. Tiếp theo, loại bỏ đường đơn giản trong dịch sản phẩm bằng nấm men Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus BE 134.
Thành phần IMO trong dịch sản phẩm được phân tích bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – RI và tính toán hàm lượng IMO234 là tổng của hàm lượng IMO2, IMO3 và IMO4. Từ đó, đánh giá được điều kiện cần thiết về mức độ thủy phân tinh bột khoai lang trước khi đưa vào tổng hợp IMO sử dụng enzyme transglucosidase.
(2) Lựa chọn chế phẩm Alpha amylase phù hợp cho quá trình dịch hóa
Lựa chọn chế phẩm alpha amylase phù hợp cho quá trình dịch hóa dựa trên xác định thành phần oligosaccharide được tạo thành sau thủy phân bởi các chế phẩm Spezyme Xtra, Liquozyme SC DS, Spezyme Alpha, Termamyl SC DS. Các thí nghiệm được tiến hành ở cùng nồng độ cơ chất là 25% (tính theo khối lượng tinh bột khô), pH 5,8 (đệm acetate 0,2M), nhiệt độ phản ứng là 80°C (Spezyme Xtra và Liquozyme SC DS), 85°C (Spezyme Alpha và Termamyl SC DS) thời gian phản ứng 30 phút, nồng độ enzyme alpha amylase 1 CU/g. Lặp lại thí nghiệm 2 lần.
Hỗn hợp thu được sau dịch hóa đem xử lý, xác định thành phần oligosaccharide bằng hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC - RI và hàm lượng tinh bột sót bằng phương pháp xác định carbohydrate tổng số. Từ đó chọn được chế phẩm enzyme phù hợp nhất với hàm mục tiêu: Hàm lượng DP 1-10 (% w/w), DP 2-6 (% w/w) lớn nhất; tinh bột sót thấp.
(3) Nghiên cứu các thông số của quá trình dịch hóa tinh bột khoai lang sử dụng enzyme α-amylase
(i) Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến quá trình dịch hóa
Để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến quá trình dịch hóa tinh bột khoai lang, tiến hành thay đổi các nồng độ tinh bột lần lượt là 15%, 20%, 25%, 30%, 35% w/v (tính theo chất khô). Các thông số còn lại được cố định bao gồm nhiệt độ 80°C, pH 5,0 (đệm acetate 0,2M), nồng độ α-amylase 0,5 CU/g cơ chất khô và thời gian phản ứng 30 phút. Kết thúc phản ứng bằng cách thêm axit lactic đặc đến pH 3,0. Lặp lại thí nghiệm 3 lần. Hỗn hợp thu được đem tiến hành xác định đương lượng đường khử DE. Chọn được nồng độ tinh bột= Ci cho khả năng thủy phân hiệu quả nhất.
(ii) Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình dịch hóa
Giữ nguyên các thông số điều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi nồng độ tinh bột được lựa chọn và nhiệt độ lần lượt là 70, 75, 80, 85, 90°C. Hỗn hợp thu được đem tiến hành xác định đương lượng đường khử DE. Chọn được nhiệt độ= Ti cho khả năng thủy phân hiệu quả nhất.
(iii) Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến quá trình dịch hóa
Giữ nguyên các thông số điều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi nhiệt độ được lựa chọn và lần lượt điều chỉnh pH bằng axit lactic và NaOH 5N đến 4,5, 5,0, 5,5, 5,8, 6,0, 6,5. Hỗn hợp thu được đem tiến hành xác định đương lượng đường khử DE. Chọn được pHi cho khả năng thủy phân hiệu quả nhất.
Giữ nguyên các thông số điều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi pH được lựa chọn và lần lượt bổ sung nồng độ enzyme α- amylase 0,1 U/g, 0,3 U/g, 0,5 U/g, 1,0 U/g, 1,5 U/g, 2,0 U/g, 2,5 U/g (tính theo khối lượng chất khô). Hỗn hợp thu được đem tiến hành xác định đương lượng đường khử DE. Chọn được nồng độ enzyme α- amylase = αi U/g cho khả năng thủy phân tốt nhất mà vẫn đảm bảo hiệu quả kinh tế.
(v) Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian thủy phân quá trình dịch hóa
Giữ nguyên các thông số điều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi nồng độ enzyme α- amylase được lựa chọn và lấy mẫu tại các thời 15, 30, 60, 90, 120, 150 phút. Hỗn hợp thu được đem tiến hành xác định đương lượng đường khử DE. Chọn được thời gian dịch hóa= ti (giờ) cho khả năng thủy phân tốt nhất mà vẫn đảm bảo hiệu quả kinh tế và phù hợp với giai đoạn đường hóa trong quy trình sản xuất IMO.
(4) Nghiên cứu các thông số của quá trình đường hóa sử dụng enzyme β- amylase và pullulanase
(i) Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình đường hóa
Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình đường hóa, tiến hành duy trì phản ứng trong các điều kiện nhiệt độ 45, 50, 55, 60 và 65°C. Các thông số còn lại được cố định bao gồm pH 5,0, nồng độ β-amylase 5 U/g, nồng độ pullulanase 0,6 U/g và thời gian phản ứng 3 giờ. Kết thúc phản ứng, diệt enzyme bằng cách đun sôi trong 10 phút. Lặp lại thí nghiệm 3 lần. Hỗn hợp thu được đem tiến hành xác định đương lượng đường khử DE. Chọn được nhiệt độ = Tii (°C) khi cho mức độ thủy phân DE cao nhất.
(ii) Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến quá trình đường hóa
Giữ nguyên các thông số điều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi nhiệt độ được lựa chọn và điều chỉnh pH dịch về các giá trị pH 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 bằng axit lactic đặc và NaOH 5N. Hỗn hợp thu được đem tiến hành xác định đương lượng đường khử DE. Chọn được pH= pHii (°C) khi cho mức độ thủy phân DE cao nhất.
(iii) Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ β-amylase đến quá trình đường hóa
Giữ nguyên các thông số điều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi pH được lựa chọn và bổ sung nồng độ β-amylase lần lượt là 1 U/g, 3 U/g, 5 U/g, 7 U/g, 9 U/g, 11 U/g. Hỗn hợp thu được đem tiến hành xác định đương lượng đường khử DE. Chọn được nồng độ β-amylase là βii (U/g) khi cho DE đạt tối thích.
(iv) Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ pullulanase đến quá trình đường hóa
Giữ nguyên các thông số điều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi nồng độ β-amylase được lựa chọn và bổ sung nồng độ pullulanase lần lượt từ 0 U/g đến 1,2 U/g. Hỗn hợp thu được đem tiến hành xác định đương lượng đường khử DE. Chọn được nồng pullulanase là Pii (U/g) khi cho DE đạt tối thích.
(v) Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian quá trình đường hóa đến sự hình thành IMO
Để lựa chọn thời gian quá trình đường hóa, tiến hành duy trì điều kiện thủy phân với các thông số đã lựa chọn và lấy mẫu tại các thời điểm khác nhau 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ, 12 giờ, 24 giờ. Tiếp đó, sử dụng dịch thu được thực hiện quá trình gắn nhánh để khảo sát ảnh hưởng của thời gian đường hóa đến hiệu quả quá trình tổng hợp IMO. Kết thúc phản ứng, diệt enzyme bằng cách đun sôi trong 10 phút.
Hỗn hợp thu được đem tiến hành xác định đương lượng đường khử DE đồng thời chuẩn bị để thực hiện giai đoạn gắn nhánh. Điều chỉnh pHii dịch sau đường hóa về pH 5,0 (sử dụng axit lactic đặc hoặc NaOH 5M), bổ sung enzyme gắn nhánh transglucosidase nồng độ 15 U/g, phản ứng diễn ra ở 50°C và duy trì trong 12 giờ. Kết thúc phản ứng, diệt enzyme bằng cách đun sôi trong 10 phút. Tiếp theo, loại bỏ đường đơn giản trong dịch bằng nấm men Saccharomyces cerevisiae var.
diastaticus BE 134. Dịch sau xử lý được xác định thành phần IMO bằng hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – RI. Chọn được thời gian đường hóa= tii (giờ) khi cho hàm lượng IMO234 là cao nhất mà vẫn đảm bảo được tính kinh tế.
(5) Nghiên cứu các thông số của quá trình gắn nhánh sử dụng enzyme transglucosidase
(i) Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến quá trình gắn nhánh tạo IMO
Để nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến quá trình gắn nhánh tạo IMO, tiến hành điều chỉnh pH dịch sau giai đoạn đường hóa về các giá trị pH 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0. Các thông số còn lại được cố định bao gồm nhiệt độ 60°C, nồng độ transglucosidase 10 U/g và thời gian phản ứng 12 giờ. Kết thúc phản ứng, diệt enzyme bằng cách đun sôi trong 10 phút. Lặp lại thí nghiệm 2 lần. Tiếp theo, loại bỏ đường đơn giản trong dịch bằng nấm men Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus BE 134. Dịch sau xử lý được xác định thành phần IMO bằng hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – RI. Chọn được pH= pHiii khi cho hàm lượng IMO234 là cao nhất mà vẫn đảm bảo được tính kinh tế.
(ii) Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình gắn nhánh tạo IMO
Giữ nguyên các thông số điều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi pH được lựa chọn và nhiệt độ phản ứng lần lượt là 50, 55, 60, 65, 70 °C. Dịch sau xử lý được xác định thành phần IMO bằng hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – RI. Chọn được nhiệt độ = Tiii (°C) khi cho hàm lượng IMO234 là cao nhất mà vẫn đảm bảo được tính kinh tế.
(iii) Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme transglucosidase đến quá trình gắn nhánh tạo IMO
Giữ nguyên các thông số điều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi nhiệt độ được lựa chọn và bổ sung nồng độ transglucosidase lần lượt là 10 U/g, 15 U/g, 20 U/g, 25 U/g, 30 U/g. Dịch sau xử lý được xác định thành phần IMO bằng hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – RI. Chọn được nồng độ transglucosidase là TGiii (U/g) khi cho hàm lượng IMO234 là cao nhất.
Giữ nguyên các thông số điều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi nồng độ transglucosidase được lựa chọn và tiến hành lấy mẫu ở các thời điểm 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ. Dịch sau xử lý được xác định thành phần IMO bằng hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – RI. Chọn được thời gian phản ứng thích hợp tiii (giờ) cho hàm lượng IMO234 là cao nhất mà vẫn đảm bảo được tính kinh tế.
2.2.2.4. Bố trí thí nghiệm thu hồi IMO từ tinh bột khoai lang bằng phương phápđường hóa – gắn nhánh đồng thời