isomaltooligosaccharide tạo thành trong giai đoạn gắn nhánh bằng transglucosidase
(1) Ảnh hưởng pH đến hàm lượng IMO tạo thành trong giai đoạn gắn nhánh bằng transglucosidase
Tác động của pH môi trường gắn nhánh lên hiệu quả hoạt động của enzyme transglucosidase thể hiện trực tiếp qua hàm lượng IMO tạo thành. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng pH trong giai đoạn gắn nhánh được tiến hành với pH phản ứng thay đổi từ 4,0 đến 6,0 trong điều kiện cố định nhiệt độ tại 60°C, nồng độ enyzme transglucosidase 10 U/g và duy trì thời gian phản ứng trong 12 giờ. Thành phần IMO trong dịch sản phẩm được phân tích bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và kết quả được tóm tắt trong đồ thị Hình 3.18.
Hình 3.38. Ảnh hưởng pH gắn nhánh đến hàm lượng IMO tạo thành
Nhận thấy, hàm lượng IMO tạo thành phụ thuộc rõ rệt vào pH của phản ứng gắn nhánh. Hàm lượng IMO tổng đạt được giá trị cao nhất 50,03 g/l tại điều kiện pH 5,0 và thấp nhất là 37,83 g/l tại pH 4,0. Thành phần IMO2,IMO3 và IMO4 tăng dần khi thay đổi pH từ 4,0 đến 5,0 và giảm dần trong khoảng pH 5,0 – 6,0. Trong đó, IMO2 chiếm phần lớn (62,1% tại pH 5,0), sau đó là IMO3 (25,9% tại pH 5,0) và chiếm phần trăm nhỏ nhất là IMO4 (12,0% tại pH 5,0). Phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt có nghĩa giữa hàm lượng IMO tổng và hàm lượng các IMO thành phần tại pH 5,0 so với giá trị tại các điểm pH còn lại. Theo thông tin được cung cấp bởi nhà sản xuất Megazyme, transglucosidase hoạt động tối ưu tại pH 4,5 và ổn định tại pH 4,0 – 6,0, gần với điều kiện được chỉ ra trong nghiên cứu này là pH 5,0. Bên cạnh đó, trong nghiên cứu của Basu và cộng sự, pH 5,0 là môi trường thích hợp cho enzyme transglucosidase (thu nhận từ Aspergillus niger) gắn nhánh khi sản xuất IMO từ tinh bột [147]. Điều kiện pH tương tự đã được Cui và cộng sự áp dụng trong nghiên cứu tạo IMO từ bột hạt dẻ [154]. Niu và cộng sự [151] cũng chứng minh hoạt độ cao nhất của transglucosidase đạt được trong khoảng pH = 5,0 - 5,5. Như vậy, điều kiện pH 5,0 tạo điều kiện hoạt động tốt nhất cho enzyme transglucosidase và hoàn toàn phù hợp với các kết quả được báo cáo trước đây. Lựa chọn pH phản ứng của giai đoạn gắn nhánh được lựa chọn là pH 5,0.
(2) Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng IMO tạo thành trong giai đoạn gắn nhánh bằng transglucosidase
Để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ lên hàm lượng IMO tạo thành, tiến hành thí nghiệm trong điều kiện thay đổi nhiệt độ từ 50°C đến 70°C, cố định pH 5,0, nồng độ enyzme transglucosidase 10 U/g và duy trì quá trình gắn nhánh trong 12 giờ. Thành phần IMO trong dịch sản phẩm được phân tích bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), kết quả được thể hiện trong Hình 3.19.
Hình 3.39. Ảnh hưởng nhiệt độ gắn nhánh đến hàm lượng IMO tạo thành
Nhận thấy, nhiệt độ phản ứng ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả IMO tạo thành. Khi tăng nhiệt độ phản ứng từ 50°C lên 60°C, nồng độ IMO234 tăng từ 39,91 g/l lên 49,84 g/l và là giá trị lớn nhất thu được. Khi nhiệt độ tăng lên 70°C thì hàm lượng IMO234 giảm nhanh xuống còn 28,97 g/l. Xu hướng này cũng được phát hiện tương tự đối với hàm lượng IMO2, IMO3 vàIMO4. Phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt có nghĩa giữa hàm lượng thành phần IMO tại các trường hợp nhiệt độ khảo sát khác nhau. Như vậy, tại nhiệt độ 60°C thu được hàm lượng IMO234 là cao nhât. Tuy nhiên, theo thông tin được cung cấp bởi nhà sản xuất, nhiệt độ tối ưu của transglucosidase là 70°C, như vậy, có sự chênh lệch so với kết quả đạt được trong nghiên cứu này. Điều này có thể được giải thích rằng, nhiệt độ tối ưu của transglucosidase được nhà sản xuất tính toán dựa trên quá trình thủy phân giải phóng gốc glucose từ đầu không khử đơn thuần chứ không phải cả quá trình thủy phân và chuyển hóa gốc glucosyl tạo liên kết α- 1,6 glycosidic [7]. Trong những nghiên cứu trước đây về sản xuất IMO trên các nguồn tinh bột khác, giai đoạn gắn nhánh bởi transglucosidase cũng được tiến hành trong khoảng nhiệt độ hoạt động phổ biến từ 55°C đến 60°C và nhận được hàm lượng IMO234 lớn nhất [146], [151]– [154]. Như vậy, lựa chọn nhiệt độ 60°C cho giai đoạn gắn nhánh bởi transglucosidase tổng hợp IMO từ tinh bột khoai lang.
(3) Ảnh hưởng nồng độ enzyme transglucosidase đến hàm lượng IMO tạo thành trong giai đoạn gắn nhánh
Tác động của nồng độ enzyme đến hàm lượng IMO được nghiên cứu trong điều kiện thay đổi lượng enyzme transglucosidase bổ sung từ 10 U/g đến 30 U/g, cố định pH gắn nhánh bằng 5,0, nhiệt độ 60°C và và duy trì quá trình gắn nhánh trong 12 giờ. Kết quả hàm lượng IMO sản phẩm được thể hiện trong Hình 3.20.
Hình 3.40. Ảnh hưởng nồng độ enzyme transglucosidase đến hàm lượng IMO tạo thành
Nhận thấy, hàm lượng IMO cao nhất thu được tại nồng độ 15 U/g (55,32 g/l) và khi tăng nồng độ enzyme sử dụng lên tới 30 U/g thì hiệu quả tổng hợp IMO lại giảm dần. Cụ thể, nồng độ 30 U/g thu hàm lượng IMO tổng lầ 41,61 g/l. Điều này có thể được giải thích bởi đặc tính enzyme transglucosidase có thể thủy phân đồng thời hai liên kết là α-1,4 và α-1,6 glycosidic, trong đó tốc độ thủy phân liên kết α- 1,4 glycosidic nhanh gấp khoảng hai lần so với α-1,6 glycosidic [146]. Do vậy, khi nồng độ transglucosidase cao, cơ chất oligosaccharide bị thủy phân nhanh tạo glucose tự do [152] làm giảm hàm lượng IMO, hơn nữa, sản phẩm IMO tạo thành cũng có thể bị thủy phân. Hai yếu tố này đều có thể làm giảm hàm lượng IMO. Phân tích thống kê cho thấy trường hợp sử dụng nồng độ transglucosidase là 15 U/g khác biệt với các trường hợp còn lại. Như vậy, lựa chọn nồng độ enzyme transglucosidase là 15 U/g sẽ cho hàm lượng IMO234 cao nhất và kinh tế nhất.
(4) Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hàm lượng IMO tạo thành trong giai đoạn gắn nhánh bằng transglucosidase
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng IMO tạo thành bằng thí nghiệm cố định các thông số đã khảo sát: pH 5,0, nhiệt độ 60°C, nồng độ enzyme transglucosidase 15 U/g và duy trì quá trình gắn nhánh trong 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Phân tích thu được kết quả nồng độ IMO thể hiện trong Hình 3.21.
Hình 3.41. Ảnh hưởng của thời gian gắn nhánh đến hàm lượng IMO tạo thành
Nhận thấy, khi kéo dài thời gian gắn nhánh từ 6 giờ đến 72 giờ, hàm lượng IMO234 thu được có xu hướng tăng và đạt giá trị lớn nhất tại 12 giờ (56,10 g/L). Tiếp đó, hàm lượng IMO2, IMO3, IMO4, đều có xu hướng giảm dần, hàm lượng IMO234