β-amylase kết hợp pullulanase.
3.3.1.2. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình dịch hóa bằng chế phẩmenzyme α- amylase enzyme α- amylase
Tiến hành nghiên cứu sự hoạt động của bốn chế phẩm enzyme alpha amylase Spezyme Xtra, Liquozyme SC DS, Spezyme Alpha, Termamyl SC DS cho quá trình dịch hóa tinh bột khoai lang. Các thí nghiệm được khảo sát ở cùng nồng độ cơ chất là 25% (tính theo khối lượng tinh bột khô), pH 5,8, nhiệt độ phản ứng là 80°C (Spezyme Xtra và Liquozyme SC DS), 85°C (Spezyme Alpha và Termamyl SC DS) thời gian phản ứng 30 phút, nồng độ enzyme alpha amylase 1CU/g. Chi tiết về hàm lượng từng thành phần oligosaccharide trong thành phần thủy phân bằng các chế phẩm được thể hiện trên Hình 3.13.
Hình 3.33. Thành phần dịch sau thủy phân sử dụng các chế phẩm enzyme α-amylase
Phân tích Hình 3.13 cho thấy, hàm lượng G6 trong dịch thủy phân của Spezyme Xtra đạt tới 20,89 g/l so với Liquozyme SC DS, Spezyme Alpha và Termamyl SC DS lần lượt chỉ đạt 18,07 g/l, 15,79 g/l và 17,02 g/l. Các thành phần G2, G3, G5 cũng cho kết quả tương tự. Tuy nhiên, với hàm lượng G4, chế phẩm Liquozyme SC DS cho kết quả cao hơn (5,06 g/l) so với các chế phẩm khác (3,38 -4,41 g/l). Dựa vào kết quả chi tiết này, có thể nhận thấy rõ những đặc tính thủy phân khác nhau của từng chế phẩm.
Đánh giá sự hình thành đường glucose, oligossacharide và hàm lượng tinh bột sót sau phản ứng, kết quả được thể hiện ở Bảng 3.14.
Nhận thấy, khi sử dụng bốn chế phẩm enzyme α-amylase khác nhau cho thành phần sau dịch hóa khác nhau. Hàm lượng oligosaccharide từ maltose đến maltodecaose (Ký hiệu: G2-G10) nằm trong khoảng từ 65,70% (Spezyme Alpha) đến 73,95% (Spezyme Xtra). Các chế phẩm Liquozyme SC DS, Spezyme Alpha, Termamyl SC DS thủy phân cho hàm lượng G2-G10 tương đồng, và khác biệt với Spezyme Xtra. Hàm lượng oligosaccharide từ maltose đến maltohexaose (Ký hiệu: G2-G6) thay đổi từ 34,46% (Spezyme Alpha) đến 49,24% (Spezyme Xtra). Liquozyme SC DS và Termamyl SC DS cho kết quả tương đồng, khác biệt với
Spezyme Alpha cũng như Spezyme Xtra (dựa theo phân tích thống kê). Hàm lượng glucose tự do tương đối thấp, chỉ từ 0,0% (Spezyme Xtra) đến 1,68% (Termamyl SC DS). Lượng tinh bột sót thấp nhất là 1,56% (Termamyl SC DS) và cao nhất đạt 2,15% (Liquozyme SC DS). Spezyme Xtra và Liquozyme SC DS thủy phân cho lượng tinh bột sót tương đồng, Termamyl SC DS và Spezyme Alpha tương đồng và khác biệt so với hai chế phẩm còn lại.
Bảng 3.19. Thành phần dịch hóa tinh bột khoai lang sử dụng các chế phẩm enzyme α- amylase Chế phẩm enzyme G2-G10 (%w/w) (%w/w)G2-G6 Glucose(%w/w) Tinh bột sót(%w/w) Spezyme Xtra 73,95±0,02a 49,24±3,19a 0,00±0,00a 1,98±0,08a Liquozyme SC DS 68,02±0,81b 40,46±0,08c 0,61±0,86bc 2,15±0,05a Spezyme Alpha 65,26±0,30b 34,32±0,48b 0,51±0,72bc 1,64±0,01b Termamyl SC DS 67,53±2,91b 39,56±1,37c 1,68±0,03bc 1,56±0,08b
Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có giá trị số mũ khác nhau thì khác nhau ở mức có nghĩa p < 0,05.
Từ những phân tích trên, Spezyme Xtra là chế phẩm cho khả năng thủy phân tạo thành G2-G10, G2-G6 cao nhất và glucose tự do là thấp nhất, đồng thời có sự khác biệt so với các chế phẩm còn lại. Hàm lượng tinh bột sót cũng tương đối thấp, cao hơn Termamyl SC DS và Spezyme Alpha. Tuy nhiên, nhiệt độ hoạt động của Spezyme Xtra là 80 ℃ thấp hơn đáng kể nhiệt độ hoạt động của hai chế phẩm trên là 85 ℃. Do vậy, sử dụng Spezyme Xtra mang lại lợi ích kinh tế hơn. Chọn chế phẩm cho quá trình dịch hóa là Spezyme Xtra.
Như vậy, lựa chọn được chế phẩm enzyme alpha amylase (Spezyme Xtra) sử dụng cho quá trình dịch hóa và thời gian dịch hóa trong quy trình sản xuất IMO từ tinh bột khoai lang bằng phương pháp thông thường (phân đoạn).
(2) Ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến quá trình dịch hóa bằng chế phẩm enzyme Spezyme Xtra
Thay đổi nồng độ tinh bột trong khoảng 15% - 35% w/w trong điều kiện cố định các thông số còn lại: nhiệt độ 80°C, pH 5,0, nồng độ α-amylase 0,5 CU/g cơ chất và thời gian phản ứng 30 phút. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ đến quá trình dịch hóa sử dụng enzyme α- amylase được thể hiện trong Bảng 3.15.
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến quá trình dịch hóa
Nồng độ tinh bột (% chất khô, w/v) DE
15 8,86 ± 0,39a
20 9,30 ± 0,42ab
30 9,17 ± 0,13a
35 8,26 ± 0,09c
Việc thay đổi nồng độ tinh bột tác động tới hiệu quả quá trình dịch hóa, được thể hiện thông qua giá trị DE của dịch sau thủy phân. Khi tăng nồng độ tinh bột từ 15% tới 25%, mức độ dịch hóa tăng dần, thể hiện qua DE tăng từ 8,86 tới 9,83. Tiếp tục tục tăng nồng độ tinh bột từ 25% lên 35%, DE có xu hướng giảm dần, từ 9,83 xuống 8,26. Tác động này có thể được giải thích do độ nhớt của tinh bột hồ hóa tăng làm hạn chế khả năng khuếch tán trong quá trình thủy phân tinh bột bằng enzyme. Mặt khác, nồng độ cơ chất cao cũng có thể là nguyên nhân gây ức chế hoạt động của enzyme. Kết quả tương tự được báo cáo bởi Ruiz và cộng sự (2011) [250]. Phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt có nghĩa giữa DE dịch sản phẩm từ các nồng độ tinh bột đem phản ứng khác nhau. Do đó, dịch tinh bột 25% tạo điều kiện hoạt động tốt nhất cho enzyme α- amylase trong nghiên cứu này.
Giai đoạn dịch hóa trong quy trình sản xuất IMO được nghiên cứu bởi Saman và cộng sự (2019) sử dụng nồng độ 25% cho dịch bột gạo và tinh bột sắn nguyên liệu [152]. Dữ liệu thu được tương tự với nguồn nguyên liệu tinh bột khác trong nghiên cứu của Niu cùng cộng sự (2017) [151] và Basu cùng cộng sự (2016) [147]. Ngoài ra, nồng độ 30% cũng được sử dụng trong khảo sát trên tinh bột hạt dẻ của Cui và cộng sự (2017) [154].
Như vậy, lựa chọn nồng độ tinh bột khoai lang là 25% w/v cho quá trình dịch hóa bằng chế phẩm enzyme Spezyme Xtra.
(3) Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình dịch hóa bằng chế phẩm enzyme Spezyme Xtra
Tiến hành nghiên cứu trên dịch tinh bột nồng độ 25%w/v (thông số lựa chọn từ nghiên cứu trên), thay đổi nhiệt độ phản ứng từ 70°C đến 90°C và cố định các thông số còn lại: pH 5,0, nồng độ α-amylase 0,5 CU/g cơ chất khô và thời gian phản ứng 30 phút. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình dịch hóa được thể hiện trong Bảng 3.16.
Khi nhiệt độ thay đổi từ 70°C đến 90°C, giá trị DE dịch thủy phân có sự thay đổi đáng kể, dao động trong khoảng từ 6,21 đến 9,83. Cụ thể, khi tăng dần nhiệt độ phản ứng từ 70°C đến 80°C, DE có xu hướng tăng theo nhiệt độ. Tiếp tục tăng nhiệt độ đến 85°C và 90°C, DE dịch giảm dần, có giá trị lần lượt là 8,36 và 7,53. Quá trình thủy phân bị giảm ở nhiệt độ cao có thể được giải thích do sự yếu đi bởi nhiệt độ cao của enzyme [251].
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình dịch hóa
Nhiệt độ dịch hóa (°C) DE
70 6,21 ± 0,29a
75 9,01 ± 0,14b
85 8,36 ± 0,35d
90 7,53 ± 0,16e
Có thể thấy, mức độ thủy phân đạt tối ưu của chế phẩm enzyme Spezyme Xtra tại 80°C. Kết quả này phù hợp với điều kiện nhiệt độ phản ứng tối thích được nhà sản xuất khuyến nghị với chế phẩm Spezyme Xtra (70- 85℃). Phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt có nghĩa giữa các DE tạo thành từ các nhiệt độ khác nhau. Như vậy, lựa chọn nhiệt độ 80℃ cho quá trình dịch hóa trong nghiên cứu này.
(4) Ảnh hưởng của pH đến quá trình dịch hóa bằng chế phẩm enzyme Spezyme Xtra
Tiến hành quá trình dịch hóa trong điều kiện thay đổi pH dịch hóa trong khoảng 4,5 đến 6,5, cố định nhiệt độ 80°C, nồng độ dịch tinh bột 25%, nồng độ α- amylase 0,5 CU/g cơ chất khô và thời gian phản ứng 30 phút. Kết quả nhận được về ảnh hưởng của pH đến quá trình dịch hóa bằng chế phẩm enzyme Spezyme Xtra được trình bày trong Bảng 3.17.
Bảng 3.22. Ảnh hưởng của pH đến quá trình dịch hóa
pH dịch hóa DE 4,5 6,96 ± 0,16a 5,0 9,81 ± 0,29b 5,5 10,37 ± 0,13b 5,8 11,00 ± 0,26c 6,0 10,32 ± 0,07b 6,5 8,52 ± 0,29d
Nhận thấy, trong khoảng khảo sát pH nêu trên, điều kiện pH 4,5 cho kết quả mức độ thủy phân thấp hơn đáng kể so với các giá trị khảo sát còn lại. Khả năng hoạt động của enzyme α- amylase tăng dần khi thay đổi pH dịch thủy phân từ 4,5 lên 5,8, sau đó có xu hướng giảm dần khi tiếp tục tăng lên đến pH 6,5. Cụ thể, trong khoảng pH 4,5 đến 5,8, giá trị DE dịch sau thủy phân tăng từ 6,96 lên 11,00. Tiếp tục tăng pH, DE dịch thủy phân thu được giảm xuống lần lượt là 10,32 và 8,52 tương ứng với pH 6,0 và 6,5. Tác động của pH đến khả năng hoạt động của enzyme dịch hóa được giải thích do quá trình ion hóa các nhóm nội phân tử protein, với enzyme α-amylase sự ion hóa diễn ra ở nhóm liên kết với cơ chất và nhóm xúc tác [155]. Kết quả thu được trong nghiên cứu này gần với điều kiện hoạt động tối thích của chế phẩm Spezyme Xtra (pH 5,5) được báo cáo bởi Shanavas cùng cộng sự (2011) [252] và hoàn toàn phù hợp với khoảng pH tối ưu 5,0 đến 6,7 được khuyến nghị bởi nhà sản xuất Dupont. Phân tích thống kê cho thấy DE tại pH phản ứng 5,8 cho kết quả cao nhất và có sự khác biệt với các giá trị còn lại.
Như vậy, lựa chọn pH 5,8 cho quá trình dịch hóa tinh bột khoai lang bằng chế phẩm Spezyme Xtra.
(5) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình dịch hóa bằng chế phẩm enzyme Spezyme Xtra
Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ enzyme α- amylase đến quá trình dịch hóa được tiến hành trên dịch tinh bột nồng độ 25%, cố định nhiệt độ 80 °C, pH 5,8, nồng độ enzyme thay đổi từ 0,3 CU/g đến 2,5 CU/g, duy trì điều kiện thủy phân thời gian 30 phút. Kết quả thu được thể hiện trong Hình 3.14.
Hình 3.34. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình dịch hóa
Sau cùng thời gian phản ứng, khi tăng nồng độ enzyme α- amylase từ 0,5 CU/g đến 2,5 CU/g, mức độ thủy phân thu được có sự chênh lệch đáng kể. Cụ thể, trong khoảng nồng độ 0,3 CU/g đến 1,0 CU/g, mức độ thủy phân thay đổi rõ rệt nhất, tăng từ 8,29 đến 15,03. Tiếp tục tăng nồng độ enzyme phản ứng lên 1,5 CU/g, 2,0 CU/g và 2,5 CU/g, DE có xu hướng tăng chậm hơn và lần lượt đạt giá trị 16,45, 17,25 và 18,51. Phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt này có nghĩa giữa các giá trị thu được. Có thể thấy, khoảng khảo sát nồng độ enzyme chưa đạt đến ngưỡng bị ức chế do chính sự tương tác giữa các phân tử enzyme, do đó, khi tăng nồng độ enzyme, khả năng tiếp xúc giữa phân tử enzyme và cơ chất tăng dẫn đến quá trình thủy phân được thực hiện nhanh chóng [253]. Tuy nhiên, khả năng thủy phân cải thiện không đáng kể sau khi nồng độ enzyme đạt 1 CU/g. Nhằm hướng tới mục tiêu nghiên cứu ứng dụng, việc giảm thiểu chi phí là vấn đề quan trọng. Do đó, nồng độ enzyme α- amylase 1,0 CU/g là phù hợp nhất cho quá trình dịch hóa của nghiên cứu mà vẫn đảm bảo tính kinh tế.
Như vậy, lựa chọn nồng độ enzyme α- amylase 1,0 CU/g với chế phẩm Spezyme Xtra bổ sung vào quá trình dịch hóa tinh bột khoai lang.
(6) Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến quá trình dịch hóa bằng chế phẩm enzyme Spezyme Xtra
Tiến hành nghiên cứu trên dịch tinh bột có nồng độ chất khô 25%, pH 5,8, nhiệt độ phản ứng 80 °C, nồng độ enzyme α- amylase 1,0 CU/g chất khô và lấy mẫu sau thời gian phản ứng 15 phút, 30 phút cho tới 150 phút (sau mỗi 30 phút). Kết quả ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến quá trình dịch hóa bằng chế phẩm enzyme Spezyme Xtra được thể hiện qua Hình 3.15.
Hình 3.35. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến quá trình dịch hóa
Nhận thấy, thời gian dịch hóa có ảnh hưởng đáng kể đến DE dịch sau thủy phân. Cụ thể, tốc độ phản ứng nhanh được thể hiện rõ trong 60 phút đầu thông qua DE dịch sản phẩm tăng nhanh từ 12,35 đến 18,76. Tiếp tục duy trì điều kiện thủy phân đến 150 phút, phản ứng có xu hướng thủy phân chậm dần và dịch thủy phân cuối có DE đạt 22,2. Kết quả này có thể được giải thích do tốc độ thủy phân của enzyme α- amylase trên chuỗi dextrin mạch dài diễn ra nhanh hơn so với chuỗi mạch ngắn. Khi quá trình thủy phân diễn ra, dung dịch hóa lỏng tăng dần số lượng chuỗi mạch ngắn, do đó, quá trình thủy phân diễn ra chậm lại. Quá trình dịch hóa tinh bột sắn bằng Spezyme Xtra có kết quả tương tự được quan sát bởi Shanavas và cộng sự (2011) [252]. Bên cạnh đó, enzyme α- amylase chỉ có thể thủy phân liên kết α-1,4 glycosidic, không thể thủy phân vị trí nhánh chứa liên kết α-1,6 glycosidic, do đó tốc độ thủy phân dịch tinh bột còn có thể được tăng lên đáng kể nếu sử dụng enzyme phân cắt liên kết nhánh. Do đó, khống chế thời gian dịch hóa dừng lại sau 60 phút là phù hợp, và đây sẽ là dịch nguyên liệu cho giai đoạn đường hóa tiếp theo dưới tác dụng của enzyme β- amylase và pullulanase.
Trong một số nghiên cứu đã công bố, giai đoạn dịch hóa trong quy trình tổng hợp IMO từ tinh bột được kiểm soát với các mức độ thủy phân khác nhau. Điều kiện dừng hoạt động enzyme α-amylase trong nghiên cứu trên bột chuối của Chockchaisawasdeea và cộng sự (2013) [146]là khi toàn bộ tinh bột đã được thủy phân thành dextrin (không tạo màu xanh lam khi thử với dung dịch KI/ I2), cách tiến hành tương tự được áp dụng trong nghiên cứu của Basu và cộng sự (2016) [147]. Với tinh bột hạt dẻ, Cui và cộng sự (2017) [154] thực hiện dịch hóa trong thời gian 120 phút, DE dịch đạt 13,8. Trong báo cáo của Niu và cộng sự (2017) [151], dịch tinh bột sau khi xử lí với enzyme α-amylase có DE khoảng 25.
Như vậy, quá trình dịch hóa tinh bột khoai lang trong quy trình chuyển hóa tạo IMO được thực hiện với dịch tinh bột có nồng độ 25% w/v trong điều kiện nhiệt độ 80 °C, pH 5,8, nồng độ enzyme α- amylase (chế phẩm Spezyme Xtra) 1,0 CU/g và duy trì phản ứng trong thời gian 60 phút. Sau quá trình dịch hóa, DE dịch thủy phân
đạt 18,76. Vô hoạt enzyme α- amylase bằng axit lactic đặc đến pH 3,0 và chuẩn bị cho giai đoạn đường hóa tiếp theo.