và pullulanase trong giai đoạn đường hóa
(1) Ảnh hưởng nhiệt độ đến sự hoạt động của enzyme β-amylase và pullulanase trong giai đoạn đường hóa
Tiến hành thí nghiệm trên dịch thủy phân sau giai đoạn dịch hóa ở điều kiện nhiệt độ thay đổi từ 45 °C đến 65 °C và cố định pH 5,0, nồng độ β-amylase 5 U/g, nồng độ pullulanase 0,6 U/g và thời gian phản ứng 3 giờ. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hoạt động của enzyme β-amylase và pullulanase trong giai đoạn đường hóa được thể hiện trong Bảng 3.18.
Bảng 3.23. Ảnh hưởng nhiệt độ đến sự hoạt động của enzyme β-amylase và pullulanase trong giai đoạn đường hóa
Nhiệt độ đường hóa (°C) DE
45 28,63 ± 1,39a
50 31,75 ± 0,53b
55 31,59 ± 0,61b
60 26,42 ± 0,86c
65 18,13 ± 0,43d
Nhận thấy, khả năng thủy phân tốt nhất của phản ứng đường hóa thu được ở điều kiện nhiệt độ 50°C và 55°C, thể hiện ở giá trị đương lượng đường khử DE cao nhất và khác biệt có nghĩa với các giá trị còn lại. Cụ thể, khi tăng nhiệt độ đường hóa từ 45°C đến 55°C, DE của dịch sau đường hóa tăng từ 28,63 đến 31,75. Tiếp tục tăng nhiệt độ đường hóa lên 60°C và 65°C, mức độ thủy phân DE giảm nhanh lần lượt là 26,42 và 18,13. Nhiệt độ hoạt động tối thích của enzyme β- amylase từ đại mạch và pullulanase lần lượt là 60°C và 55- 60°C (thông tin do nhà sản xuất cung cấp). Tuy nhiên, nhiệt độ ổn định của chúng tương ứng chỉ dưới 60°C và dưới 50°C, chính vì thế, DE thu được thấp hơn ở nhiệt độ lớn hơn hoặc bằng 60°C. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Niu và cộng sự (2017) [151] đã chỉ ra hai enzyme β-amylase (từ đại mạch) và pullulanase (từ Bacillus licheniformis) đều giữ được trên 50% hoạt tính tối đa trong khoảng nhiệt độ 50-60℃. Giai đoạn đường hóa sản xuất IMO trong báo cáo của Saman và cộng sự (2019) [152] cũng lựa chọn nhiệt độ 50°C cho việc sử dụng đồng thời hai enzyme gồm pullulanase và β- amylase cho. Do đó, nhiệt độ 50- 55°C là điều kiện hoạt động tốt nhất cho cả hai enzyme.
Như vậy, lựa chọn điều kiện nhiệt độ 50°C cho giai đoạn đường hóa bằng β- amylase và pullulanase vẫn tạo điều kiện thủy phân tốt, hơn nữa tiết kiệm chi phí năng lượng so với 55℃.
(2) Ảnh hưởng pH đến sự hoạt động của enzyme β-amylase và pullulanase trong giai đoạn đường hóa
Nghiên cứu được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ đường hóa 50°C, pH thay đổi từ 4,5 đến 6,5 và cố định nồng độ β-amylase 5 U/g, nồng độ pullulanase 0,6 U/g và thời gian phản ứng 3 giờ. Kết quả thu được về sự ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme β-amylase và pullulanase trong giai đoạn đường hóa được mô tả trong Bảng 3.19.
Bảng 3.24. Ảnh hưởng pH đến sự hoạt động của enzyme β-amylase và pullulanase trong giai đoạn đường hóa
pH đường hóa DE 4,5 19,74 ± 0,57a 5,0 31,75 ± 0,53bc 5,5 31,76 ± 1,17bc 6,0 32,78 ± 1,01c 6,5 30,98 ± 0,87b
Nhận thấy, khả năng hoạt động của hai enzyme tương đối ổn định trong khoảng pH 5,0 – 6,0 với đương lượng đường khử dao động từ 31,75 đến 32,78. Ngoài khoảng pH trên, phản ứng cho kết quả DE dịch sau thủy phân thấp hơn là 30,98 và 19,74 tương ứng với pH 6,5 và pH 4,5. Điều kiện pH tối ưu được cung cấp bởi Megazyme của β-amylase và pullulanase lần lượt là 6,0 và 4,5 - 5,5. Do đó, ở pH 4,5 chỉ riêng hoạt động của enzyme pullulanase đạt tối ưu, ngược lại, enzyme β- amylase lại hoạt động không hiệu quả tại pH này dẫn đến DE dịch sau phản ứng thấp hơn đáng kể so với các điều kiện còn lại. Phân tích thống kê cho thấy DE tại pH 6,0 có giá trị cao nhất và khác biệt với các giá trị còn lại. Do đó, pH 6,0 là điều kiện tối thích cho sự hoạt động đồng thời của hai enzyme β-amylase và pullulanase trong điều kiện khảo sát của nghiên cứu. Hoạt tính của enzyme β-amylase và pullulanase cùng nguồn gốc được phân tích trong nghiên cứu của Niu và cộng sự (2017) [151] cũng cho thấy hoạt tính cao nhất khi sử dụng đồng thời cả hai enzyme thu được trong khoảng pH 5,0 đến 6,0 và đạt trên 50% hoạt tính tối đa của chúng. Ngoài ra, điều kiện pH 6,0 cũng được Saman và cộng sự (2019) [152] lựa chọn cho quá trình đường hóa sử dụng hai enzyme gồm β-amylase và pullulanase trong quy trình sản xuất IMO.
Như vậy, pH 6,0 được lựa chọn cho giai đoạn đường hóa của quá trình tổng hợp IMO từ tinh bột khoai lang.
(3) Ảnh hưởng nồng độ enzyme β-amylase đến quá trình đường hóa
Tiến hành thí nghiệm bằng cách thay đổi nồng độ enzyme β- amylase từ 1 CU/g đến 11 CU/g, điều chỉnh pH = 6,0, cố định nhiệt độ đường hóa 50°C, nồng độ enzyme pullulanase 0,6 U/g và thời gian phản ứng duy trì trong 3 giờ. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.20.
Bảng 3.25. Ảnh hưởng nồng độ enzyme β-amylase đến quá trình đường hóa
Nồng độ enzyme β- amylase DE
3,0 30,69 ± 0,67b
5,0 32,78 ± 1,01c
7,0 34,00 ± 0,41cd
9,0 34,67 ± 1,02d
11,0 35,15 ± 1,34d
Enzyme β- amylase thủy phân đặc hiệu các liên kết α-1,4 glycosidic từ đầu không khử trong phân tử maltodextrin tạo thành maltose [254], do đó số lượng gốc khử được giải phóng trong dung dịch tăng nhanh, làm DE tăng. Khi tăng nồng độ enzyme β-amylase từ 1,0 U/g đến 11 U/g, dịch thủy phân thu được có DE tăng đáng kể. Trong đó, giá trị DE tăng nhanh từ 22,12 lên 32,78 tương ứng với nồng độ từ 1 U/g lên 5 U/g. Tiếp tục tăng nồng độ enzyme β-amylase lên 11 U/g, giá trị DE thu được chỉ tăng thêm 7% (từ 32,78 đến 35,15). Phân tích thống kê cho thấy, trường hợp nồng độ enzyme từ 1 U/g, 3 U/g và 5 U/g cho kết quả DE khác biệt có nghĩa. DE của dịch ở trường hợp nồng độ enzyme là 5 U/g có không có sự khác biệt với 7 U/g, kết quả DE từ 9 U/g, 11 U/g, 7 U/g là tương đồng. Vậy, lựa chọn nồng độ enzyme β- amylase 5 U/g cho giai đoạn đường hóa do nó mang lại hiệu quả hoạt động cao mà vẫn đảm bảo tính kinh tế.
(4) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme pullulanase đến quá trình đường hóa
Tiến hành thí nghiệm trên dịch thủy phân sau giai đoạn dịch hóa ở điều kiện nhiệt độ 50°C, pH 6,0, nồng độ enzyme β-amylase 5 U/g, thay đổi nồng độ enzyme pullulanase từ 0 đến 1,2 U/g và cố định thời gian đường hóa 3 giờ. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ enzyme pullulanase đến quá trình đường hóa được trình bày trong Bảng 3.21.
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ enzyme pullulanase khác nhau được bổ sung vào dung dịch phản ứng đã cho thấy sự tác động đến đương lượng đường khử thu được sau thủy phân. Mẫu đối chứng không bổ sung pullulanase cho mức độ thủy phân đạt DE 27,45, tuy nhiên giá trị này đã đạt tối đa 34,92 khi bổ sung nồng độ 1,2 U/g enzyme pullulanase. Từ đó đã cho thấy vai trò của enzyme cắt nhánh trong giai đoạn đường hóa. Pullulanase có mặt trong dịch thủy phân đã tác động lên các phân tử cơ chất lớn phân nhánh có khả năng chống lại tác động của β- amylase, sản phẩm tạo thành là các maltodextrin mạch thẳng có độ dài khác nhau, dẫn đến hàm lượng cơ chất có thể tham gia vào chuyển hóa maltose tăng [151].
Bảng 3.26. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme pullulanase đến quá trình đường hóa
Nồng độ enzyme pullulanase (U/g) DE 0 27,45 ± 0,42a 0,2 30,06 ± 0,18b 0,4 31,05 ± 0,96b 0,6 32,78 ± 1,01c 0,8 33,97 ± 0,62d
1,0 34,14 ± 0,41d
1,2 34,92 ± 0,80d
Khi nồng độ enzyme pullulanase bổ sung tăng từ 0,2 U/g lên 1,2 U/g, DE dịch thủy phân có xu hướng tăng dần từ 30,06 đến 34,92. Kết quả có xu hướng tăng rõ ràng hơn trong khoảng nồng độ 0,2 U/g đến 0,8 U/g, sau đó tiếp tục tăng nồng độ enzyme đến 1,0 U/g và 1,2 U/g thì kết quả thu được có sự tương đồng. Phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt có nghĩa giữa nồng độ enzyme 0,8 U/g với các trường hợp sử dụng lượng enzyme thấp hơn (mức sai khác có nghĩa p < 0,05). Do đó, bổ sung nồng độ pullulanase 0,8 U/g kết hợp với enzyme β- amylase 5 U/g là điều kiện tối thích cho giai đoạn đường hóa thuộc quy trình sản xuất IMO từ tinh bột khoai lang.
(5) Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến quá trình đường hóa bằng enzyme β- amylase và pullulanase
Để đánh giá tác động của thời gian thủy phân đến quá trình đường hóa, tiến hành thí nghiệm trong điều kiện nhiệt độ 50°C, pH 6,0, bổ sung enzyme β- amylase nồng độ 5 U/g và pullulanase 0,8 U/g, duy trì phản ứng và lấy mẫu tại một số mốc thời gian trong khoảng từ 1 giờ đến 24 giờ. Kết quả mức độ thủy phân của các mẫu được trình bày trong Bảng 3.22.
Bảng 3.27. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến quá trình đường hóa bằng enzyme β- amylase và pullulanase
Thời gian đường hóa (giờ) DE
1 23,94 ± 1,14b 2 30,26 ± 0,53c 3 33,97 ± 0,62d 6 35,68 ± 0,39e 12 36,88 ± 1,59e 24 36,91 ± 0,73e
Nhận thấy, khi thời gian đường hóa tăng dần từ 1 đến 24 giờ, DE thu được có sự thay đổi rõ ràng từ 23,94 đến 36,91. Trong thời gian từ 1 đến 6 giờ đầu của phản ứng, DE thể hiện xu hướng tăng nhanh (23,94 - 35,68). Tiếp tục kéo dài thời gian đường hóa lên 12 giờ và 24 giờ, giá trị DE thay đổi không đáng kể lần lượt là 36,88 và 36,91. Phân tích thống kê cho thấy, không có sự khác biệt có nghĩa giữa các kết quả thu được từ quá trình đường hóa với thời gian 6 giờ, 12 giờ và 24 giờ. Điều này được giải thích do sau thời gian đường hóa 6 giờ, thành phần các oligosaccharide trong hỗn hợp thu được bắt đầu có xu hướng thay đổi chậm, quá trình đường hóa gần như hoàn thành với maltose, maltotriose là sản phẩm chính và một số các sản phẩm phụ khác.
Hình 3.36: Ảnh hưởng của thời gian đường hóa thành phần oligosaccharide (G2: maltose, G3: maltotriose, G4: maltotetraose, G5-G10: tổng maltopentaose,
maltoheptaose, maltooctaose, maltononaose và maltodecaose)
Tương tự giá trị DE, trong thời gian từ 0 đến 6 giờ đường hóa, hàm lượng maltose (G2) tạo thành tăng đáng kể từ 5,13% đến 50,31%. Tiếp tục duy trì phản ứng, nồng độ maltose thay đổi rất chậm, lần lượt tăng 4,03% sau 12 giờ (54,34%) (Hình 3.16). Maltotriose là sản phẩm quan trọng thứ hai sau maltose. Hàm lượng maltotriose cũng tăng dần theo thời gian đường hóa, từ 10,30% trong hỗn hợp sau dịch hóa tăng lên 20,20% sau đường hóa 12 giờ. Đặc biệt, phần lớn sự biến đổi chỉ diễn ra trong 6 giờ đầu đường hóa, thời gian sau đó hàm lượng oiligosaccharide này tương đối ổn định. Có thể thấy, hàm lượng G2 và G3 tăng là kết quả quá trình tác động của β-amylase và pullulanase lên các phân tử maltooligosaccharide có mạch dài hơn, do đó, hàm lượng các thành phần này sẽ giảm dần trong quá trình phản ứng. Cụ thể, sự tạo thành maltotetraose (G4) chỉ tăng trong 1 giờ đầu đường hóa (từ 3,86% lên 12,94%), sau đó giảm dần về xấp xỉ bằng 0 sau 6 giờ phản ứng. Tương tự, G5-10 giảm mạnh từ 39,07% về 3,28% sau 12 giờ. Trong nghiên cứu đã được báo cáo bởi Lin và cộng sự năm 2013 [255], xu hướng biến đổi các oligosaccharide trong giai đoạn đường hóa với β-amylase và pullulanase từ tinh bột ngô và gạo hoàn toàn tương đồng với kết quả này. Như vậy, tùy thuộc vào thời gian đường hóa, thành phần có sự thay đổi mạnh nhất là maltose và maltotriose, tăng từ 12,39% lên 75,10% sau 12 giờ.
Thành phần maltose, maltotriose và các oligosaccharide khác tạo thành từ quá trình dịch hóa và đường hóa là cơ chất cho sự chuyển hóa tạo isomaltooligosaccharide với transglucosidase, do đó, chúng có tác động trực tiếp đến hàm lượng IMO tạo thành. Hình 3.17 thể hiện tổng hàm lượng IMO2, IMO3, IMO4 (IMO234) và thành phần cụ thể tạo thành từ dịch thủy phân có các khoảng thời gian đường hóa khác nhau.
Nhận thấy, khi dịch thủy phân có thời gian đường hóa càng kéo dài thì hàm lượng IMO234 thu được ở giai đoạn gắn nhánh càng tăng lên. Trong đó, với thời gian đường hóa tăng từ 1 giờ đến 6 giờ hàm lượng IMO trong dịch sau gắn nhánh có xu hướng tăng mạnh (40,66 g/l đến 53,38 g/l). Tiếp tục kéo dài thời gian đường hóa đến 12 giờ và 24 giờ thì hàm lượng IMO thu được tăng chậm lên 55,12 g/l. Trong đó, isomaltose (IMO2) chiếm phần lớn trong hỗn hợp sản phẩm (trên 60%), sau đó là isomaltotriose (IMO3) và cuối cùng là isomaltotetraose (IMO4). Kết quả này được giải thích bởi cơ chế tác động của transglucosidase, enzyme thủy phân từ đầu không khử và tạo liên kết α- 1,6 glycosidic với các cơ chất nền có trong dung dịch, do đó, IMO2 là sản phẩm hình thành đầu tiên trong ba hợp chất được quan tâm, theo sau đó là IMO3 và IMO4. Kết quả trên đã chỉ ra vai trò tăng cường sự hình thành IMO của enzyme β-amylase và pullulanse thông qua việc tăng hàm lượng của maltose, maltotriose và các maltooligosaccharide khác, do đó thúc đẩy quá trình chuyển hóa đường bằng transglucosidase [151]. Phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt có nghĩa của hàm lượng IMO tạo thành từ mẫu đường hóa 6 giờ so với các khoảng thời gian trước đó, mẫu đường hóa 24 giờ cho kết quả lớn nhất. Tuy nhiên, việc tăng tăng thời gian đường hóa gấp 4 lần với hiệu suất IMO tăng 1,74 g/l không đảm bảo giá trị kinh tế. Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn kết thúc đường hóa sau 6 giờ và đưa hỗn hợp vào giai đoạn gắn nhánh.
Tóm lại, quá trình đường hóa trong quy trình chuyển hóa tạo IMO được thực hiện bằng enzyme β-amylase nồng độ 5,0 U/g và enzyme pullulanase nồng độ 0,8 U/g ở điều kiện nhiệt độ 50°C, pH 6,0 và duy trì phản ứng trong thời gian 6 giờ. Kết thúc giai đoạn đường hóa, DE dung dịch đạt 35,68. Vô hoạt enzyme bằng cách đun sôi hỗn hợp trong vòng 10 phút và chuẩn bị cho giai đoạn gắn nhánh tiếp theo.