gắn nhánh là 12 giờ. IMO được tạo ra bằng cách chuyển các đơn vị glucosyl tại vị trí liên kết α-1,4 glycosidic đến vị trí 6 của chất nhận carbohydrate trong chuỗi phản ứng, nhưng sẽ giải phóng glucose tự do nếu các đơn vị glucosyl được chuyển vào nước [149], [256]. Các enzyme transglucosidase có thể sử dụng các IMO được tạo ra làm chất nền để gắn nhánh và thủy phân chúng. Chockchaisawasdeea và cộng sự (2012) nhận thấy tốc độ phản ứng thủy phân liên kết α-1,4 glycosidic nhanh gấp hai lần tốc độ phản ứng thủy phân liên kết α-1,6 glycosidic [146]. Do đó, cần có một thời gian tối ưu để sự hình thành IMO đạt đến hàm lượng tối đa và sau đó bắt đầu giảm do hoạt động thủy phân của enzyme. Kết quả tương tự được quan sát bởi Cui và cộng sự (2017) trong quy trình tổng hợp IMO từ bột hạt dẻ [154].
Như vậy, quá trình gắn nhánh tổng hợp IMO được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ 60°C, pH 5,0, nồng độ enzyme transglucosidase 15 CU/g và duy trì phản ứng trong thời gian 12 giờ. Nồng độ IMO234 trong dịch sản phẩm đạt 56,10 ± 0,25 g/l.
3.3.1.5. Quy trình sản xuất IMO từ tinh bột khoai lang bằng phương pháp phânđoạn đoạn
Thiết lập quy trình chuyển hóa tạo isomaltooligosaccharide từ tinh bột khoai lang gồm ba giai đoạn dịch hóa, đường hóa và gắn nhánh với các thông số công nghệ được trình bày trong Hình 3.22. Hàm lượng IMO234 trong dịch sản phẩm đạt 56,10 g/l.
Hình 3.42. Quy trình sản xuất IMO từ tinh bột khoai lang bằng phương pháp phân đoạn
Dịch tinh bột 25% được pha trong môi trường đệm natri acetate 0,2M pH 5,8. Bổ sung enzyme α-amylase từ chế phẩm Spezyme Xtra với nồng độ 1,0 CU/g tinh bột. Nâng nhiệt độ của hỗn hợp lên 80°C và duy trì trong thời gian 60 phút. Khi kết thúc phản ứng, diệt enzyme bằng cách hạ pH dung dịch xuống 3,0 sử dụng axit lactic đặc.
Trước khi bước vào giai đoạn đường hóa, điều chỉnh pH dịch thủy phân đến pH 6,0 và ổn nhiệt trong điều kiện nhiệt độ 50℃. Bổ sung enzyme pullulanase nồng độ 0,8 U/g và enzyme β- amylase nồng độ 5 U/g vào dịch thủy phân để tiến hành đường hóa. Duy trì điều kiện phản ứng trong vòng 6 giờ. Kết thúc phản ứng, tiến hành vô hoạt enzyme bằng cách đun sôi trong 10 phút.
Để tiến hành giai đoạn gắn nhánh, điều chỉnh pH dịch thủy phân đến pH 5,0 bằng axit lactic đặc và ổn nhiệt ở 60°C. Sau đó, thêm enzyme transglucosidase nồng độ 10 U/g và duy trì phản ứng trong 12 giờ để quá trình gắn nhánh diễn ra. Kết thúc phản ứng, diệt enzyme bằng cách đun sôi trong 10 phút.
Tiếp theo, loại bỏ đường đơn giản trong dịch bằng nấm men Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus BE 134. Nấm men được hòa tan trong nước cất, hoạt hóa ở 28°C trong 15 phút. Thêm vào hỗn hợp IMO sao cho mật độ tế bào S. cerevisiae
trong mẫu là 2,0 x 108 tế bào/ml. Hỗn hợp được ổn nhiệt ở 28 °C. Quá trình lên men diễn ra cho đến khi không còn phát hiện thành phần glucose, maltose và maltotriose (định tính bằng TLC). Để kết thúc quá trình lên men, tiến hành diệt nấm men ở 95 °C trong 10 phút. Tế bào nấm men được loại bỏ bằng cách ly tâm ở 10000 ×g trong 15 phút. Dịch trong thu được là hỗn hợp IMO sản phẩm có nồng độ IMO234 trong đạt 56,10 ± 0,25 g/l.
Trong xu hướng phát triển của thị trường IMO thương mại, các phương pháp sản xuất cho hiệu suất tạo thành IMO cao ngày càng được quan tâm. Việc kết hợp quá trình đường hóa và gắn nhánh đã được chứng minh mang lại hiệu quả cao hơn so với quy trình ba bước thông thường [147], [151]. Một nghiên cứu về hiệu quả của quá trình đường hóa - gắn nhánh đồng thời được thể hiện qua phân tích sắc ký bản mỏng TLC dưới đây (Hình 3.23).
Quan sát Hình 3.23 ta thấy khi enzyme β-amylase hoạt động độc lập, hàm lượng maltose và maltotriose tăng lên rất nhanh sau thời gian thủy phân từ 1 giờ đến 3 giờ. Tuy nhiên, khi sử dụng đồng thời ba enzyme β-amylase, pullulanase, transglucosidase ngay trong 1 giờ đến 3 giờ đầu, hàm lượng maltose và maltotriose luôn ở mức thấp và giảm dần theo thời gian. Điều này chứng tỏ sự hoạt động hiệu quả của transglucosidase trên cơ chất là sản phẩm được tạo thành nhờ β-amylase và pullulanase. Hơn nữa, sản phẩm tạo thành là IMO2 và IMO3 cũng xuất hiện lượng đáng kể.
Như vậy, sản xuất IMO theo phương pháp đường hóa - gắn nhánh đồng thời là một cải tiến giúp nâng cao hiệu suất tạo thành IMO so với phương pháp phân đoạn truyền thống. Phương pháp cũng được chứng minh mang lại sự đa dạng cấu trúc thành phần hỗn hợp IMO sản phẩm, giảm giá thành sản xuất nhờ tiết kiệm thời gian, năng lượng đồng thời cho hiệu suất tạo thành IMO cao hơn. Nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số phản ứng đến hàm lượng IMO sản phẩm bằng phương pháp đường hóa – gắn nhánh đồng thười được tiến hành trong các nghiên cứu tiếp theo
Hình 3.43. Thành phần đường trong dịch sau đường hóa và sau đường hóa - gắn nhánh đồng thời
Ghi chú: Cột 1: Các chuẩn đường; Cột 2,3,4: Thời gian thủy phân tinh bột sau quá trình đường hóa bằng enzyme β-amylase trong 1 giờ, 3 giờ, 6 giờ; Cột 5 – 10: Thời gian đường hóa – gắn nhánh đồng thời trong thời gian 1 giờ đến 36 giờ.