Phần 3 Nội dung và Phương pháp nghiên cứu
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.3. Phương pháp gây bệnh thực nghiệm và điều trị thực nghiệm
3.3.3.1. Thiết kế thí nghiệm
Động vật thí nghiệm gồm 20 con, chó 2 tháng tuổi có trọng lượng từ 2- 3 kg/con.Chó thí nghiệm được chọn là chó không mắc virus Care và các virus khác (bệnh Parvovirus, bệnh viêm gan truyền nhiễm....) và không có kháng thể kháng virus Care.
Hai mươi chó thí nghiệm được chia thành 4 lô:
Lô 1: gây nhiễm bằng virus CDV-HV, sau gây nhiễm 3 ngày điều trị thử nghiệm bằng phác đồ 1.
Lô 2: gây nhiễm bằng virus CDV-HV, sau gây nhiễm 3 ngày điều trị thử nghiệm bằng phác đồ 2.
Lô 3: đối chứng dương gây nhiễm mà không điều trị, nghiên cứu các đặc điểm bệnh lý để so sánh.
Lô 4: đối chứng âm không gây nhiễm.
Các lô được nuôi riêng biệt ở các chuồng khác nhau tại khu nuôi động vật thí nghiệm đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học cấp 2 của khoa Thú y.
Khu nuôi động vật thí nghiệm được vệ sinh sạch sẽ, thường xuyên phun thuốc sát trùng. Các dụng cụ sử dụng luôn đúng quy định vô trùng không để lây nhiễm mầm bệnh từ bên ngoài vào và từ phòng thí nghiệm sang phòng đối chứng (sử dụng các dụng cụ trong phòng đối chứng và phòng gây nhiễm luôn phải riêng biệt,
43
khi đi từ bên ngoài vào trong phòng thí nghiệm luôn luôn phải mặc áo blue và đi ủng, đeo khẩu trang, sát trùng trước khi vào phòng thí nghiệm...).
Virus sử dụng để gây bệnh là chủng virus Care (CDV-HV) của Học viện Nông nghiệp Việt Nam, được phân lập từ chó mắc bệnh Care tại địa bàn Hà Nội. Chó này có biểu hiện đặc trưng của bệnh Care như: chó kém ăn, sốt 40 – 410C, ủ rũ, mệt mỏi... Ngoài ra còn có hiện tượng tiêu chảy, thở khó, có nốt sài và có triệu chứng thần kinh. Virus được nuôi cấy, phân lập trên dòng tế bào VERO - DST tại phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú Y đạt hiệu giá virus là 106 TCID50/ml.
3.3.3.2. Gây bệnh thực nghiệm
Trước khi gây nhiễm chó được nuôi 7 ngày để theo dõi tình hình sức khỏe, đo nhiệt độ, và đồng thời để chó thích nghi với điều kiện mới (trong phòng thí nghiệm).
Lấy máu kiểm tra các chỉ tiêu huyết học, chắt huyết thanh kiểm tra kháng thể Care bằng phương pháp ELISA, kiểm tra sự có mặt của virus Care và một số mầm bệnh khác (virus dại, Leptospira, virus viêm gan,...) bằng phương pháp RT - PCR để khẳng định chó thí nghiệm chưa từng tiếp xúc với virus Care.
Gây nhiễm bằng phương pháp khí dung qua niêm mạc mũi, hầu họng bằng chủng CDV-HV, liều 106TCID50/ ml/con.
Sau khi gây nhiễm tiến hành theo dõi chó chặt chẽ, lấy phân và dịch swab vào tất cả các ngày sau khi gây nhiễm để kiểm tra sự đào thải virus (thời gian đầu tiên đào thải virus, số lượng virus đào thải qua từng con đường và thời gian đào thải mầm bệnh hết khỏi cơ thể).
Lấy máu vào các ngày 1, 3, 7, 10, 14, 21 sau khi gây nhiễm để kiểm tra sự có mặt của virus và các chỉ tiêu huyết học so sánh với đối chứng.
3.3.2.3. Phương pháp khám triệu chứng lâm sàng
Triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh Care được xác định thông qua theo dõi, quan sát và ghi chép đầy đủ từ bước bắt đầu nuôi chó, sau khi gây nhiễm, cho đến khi chó có triệu chứng bệnh điển hình hoặc chết. Những chỉ số lâm sàng cơ bản được chúng tôi kiểm tra là thân nhiệt, nhịp tim, tần số hô hấp và biểu hiện hoạt động của chó. Đồng thời chúng tôi theo dõi chó ở lô đối chứng để so sánh với chó ở lô thí nghiệm.
44
3.3.3.4. Phương pháp RT-PCR xác định sự có mặt của virus Care trong mẫu bệnh phẩm
a. Thu thập và xử lý mẫu
+ Đối với mẫu swab và mẫu phân: Dùng tăm bông vô trùng lấy dịch mắt và mũi của chó nghi bệnh Care, cho tăm bông đã lấy mẫu vào ống eppendorf vô trùng có chứa sẵn 300 μl dung dịch đệm PBS (Phosphat buffer saline). Mẫu được bảo quản lạnh có đá khô và chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ sau khi lấy mẫu. Mẫu được tách chiết RNA ngay hoặc bảo quản tủ âm -80oC tới khi được chiết tách RNA.
Mẫu RNA chứa virus Care sau khi tách chiết sẽ được tiến hành phản ứng RT- PCR theo bộ Kit Qiagen One-step RT-PCR. Trong đó, các cặp mồi được sử dụng gồm mồi (Upp1; Upp2) nhân đoạn gen P (Phosphoprotein) do công ty Greiner- bio-one (Nhật Bản) cung cấp và chu kì nhiệt phản ứng RT-PCR theo nghiên cứu của (Lan & cs., 2005).
b. Thực hiện phản ứng RT-PCR
Để xác định sự có mặt của virus Care trong máu, dịch swab (nhử mắt, mũi) và phân của chó bằng các cặp mồi đặc hiệu với chủng virus Care.
Chu trình luân nhiệt như sau: phiên mã ngược nhiệt độ 42oC trong 15 phút, giai đoạn biến tính nhiệt độ 94oC trong 10 phút; với 40 chu kỳ được lặp lại: giai đoạn biến tính nhiệt độ 94oC trong 1 phút, giai đoạn bắt cặp nhiệt độ 52oC trong 2 phút, giai đoạn kéo dài nhiệt độ 72oC trong 1 phút; cuối cùng là giai đoạn hoàn thành nhiệt độ 72oC trong 10 phút. Điện di trên agarose 1% để kiểm tra sản phẩm RT-PCR.
3.3.3.5. Phương pháp kiểm tra một số chỉ tiêu huyết học của chó sau khi gây bệnh
Phương pháp lấy máu: lấy máu chó vào buổi sáng trước khi cho ăn. Chó được cố định để đảm bảo an toàn cho người lấy mẫu. Vệ sinh chân trước bằng cồn sát trùng, dùng xi lanh chọc vào tĩnh mạnh chân trước, bỏ 2-3 giọt đầu, sau đó máu được hứng vào 2 ống, trong đó một ống có sẵn chất chống đông EDTA, và ống còn lại không có chứa chất chống đông. Huyết thanh chiết rút từ mẫu máu được bảo quản lạnh trong đá, sau đó được ly tâm (2500 vòng/15 phút). Xác định hồng cầu bằng buồng đếm Neubauer; xác định bạch cầu bằng buồng đếm Neubauer;
45
định lượng Hemoglobin (Hb) bằng huyết sắc kế Shali. Đo các chỉ tiêu huyết học bằng máy Cell - DYN 3700.
3.3.3.6. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch
Sử dụng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) đối với các mẫu bệnh phẩm (phổi, hạch, ruột, lách...) theo phương pháp của Carpenter (1998); Lan & cs. (2009). Khi có mặt virus trong tổ chức đem làm hóa mô miễn dịch kết quả dương tính sẽ là sự hiện màu nâu vàng trên lát cắt tổ chức (màu của DAB). Virus tập trung càng nhiều, màu càng rõ, mức dương tính càng cao.