Phần 3 Nội dung và Phương pháp nghiên cứu
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm của bệnh Care
3.3.1.1. Phương pháp điều tra phát hiện bệnh
Điều tra phát hiện bệnh dựa vào thống kê hồ sơ bệnh án, mô tả bệnh, thống kê sinh học, phương pháp hồi cứu và phương pháp cắt ngang (điều tra theo dõi và phỏng vấn chủ vật nuôi, kết hợp theo dõi và quan sát trực tiếp). Cụ thể như sau:
* Phương pháp xác định chó mắc bệnh Care
Xác định chó bệnh được dựa vào lịch tiêm phòng vacxin, những triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh, bệnh tích điển hình như các tác giả (Appel Max Jg & cs., 1994; Frölich & cs., 2000; Martella & cs., 2002); (Trần Văn Nên & cs., 2017) đã mô tả. Mặt khác, trong phòng thí nghiệm, test chẩn đoán nhanh được dùng để xác định bệnh những con chó có các triệu chứng bệnh Care điển hình.
36
Những trường hợp chó có triệu chứng bệnh Care điển hình khi chẩn đoán bằng test chẩn đoán nhanh cho kết quả âm tính thì chúng tôi tiến hành chẩn đoán bằng phản ứng RT- PCR để loại trừ.
Tất cả những chó bị bệnh ở các lứa tuổi và các mùa trong năm, đưa đến khám tại Bệnh Viện Thú cảnh của công ty Hanvet, Bệnh viện thú y Petheath, Bệnh viện thú y Hải Đăng, Bệnh viện thú 2 vet tại Hà Nội được tiến hành kiểm tra thăm hỏi bệnh từ chủ vật nuôi và khám lâm sàng.
Trong nghiên cứu chúng tôi đã thực hiện nội dung theo các bước: Lập bệnh án theo dõi và điều trị; Lấy mẫu làm test chẩn đoán nhanh; Thống kê tổng số chó mang đến và số chó mắc bệnh Care.
* Phương pháp chẩn đoán bệnh Care bằng test CDV Ag
Nguyên tắc hoạt động của kit CDV Ag: dựa trên phương pháp sắc phổ miễn dịch (immunochromatography assay). Kháng nguyên sẽ kết hợp với kháng thể tạo thành phức chất miễn dịch. Chất đánh dấu trên kháng thể là những kim loại keo như vàng keo có màu đỏ/hồng. Sau đó, phức chất miễn dịch được đưa vào vùng phát hiện có chứa kháng thể cố định chống kháng nguyên và như vậy việc kết hợp giữa kháng thể và phức chất miễn dịch xảy ra. Lúc này xuất hiện những vạch nhuộm màu. Đọc kết quả dựa trên những vạch này.
Lấy mẫu chẩn đoán nhanh bệnh Care bằng test CDV Ag (Asan Pharmaceutical Co., LTD; Hàn Quốc) theo hướng dẫn của nhà cung cấp:
Thấm tăm bông bằng dung dịch muối NaCl 0,9%;
Phết tăm bông vào vị trí lấy mẫu: gồm rỉ mắt, mũi, phân; Cho tăm bông vào lọ có chứa sẵn dung dịch đệm để vài giây; Nhỏ dung dịch vào test thử;
Đọc kết quả sau 10- 15 phút;
Nếu chỉ có một vạch hồng xuất hiện ở vị trí C (control) trên Test thử thì phản ứng là âm tính; Nếu có hai vạch hồng xuất hiện ở vị trí (control) và T (Test) trên test thử thì phản ứng là dương tính.
37
(Mẫu âm tính; (B) Mẫu dương tính; (C & D) kết quả bị lỗi.)
Hình 3.1. Minh họa cho kết quả kiểm tra nhanh bệnh Care bằng test CDV Ag
Những con chó dùng trong nghiên cứu được thực hiện làm test chẩn đoán nhanh dưới sự đồng ý của chủ chó. Đồng thời, chủ của những con chó có biểu hiện lâm sàng đặc trưng của bệnh Care sẽ quyết định có hoặc không điều trị do quá trình điều trị kéo dài và tỷ lệ thành công không giống nhau giữa các ca bệnh. Những chó sau thời gian điều trị tiếp tục được theo dõi để kết luận điều trị thành công (hồi phục trở lại) hay thất bại (chết).
3.3.1.2. Phương pháp kiểm tra bệnh tích đại thể và vi thể ở chó bị bệnh Care
Mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể của chó được gây nhiễm theo tiêu chuẩn trong TCVN 8402: 2010 (Bộ Khoa học & Công nghệ, 2010). Mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể đối với chó chết mắc bệnh Care qua chẩn đoán lâm sàng và test thử CDV Ag có kết quả dương tính với virus Care. Sau đó lấy mẫu ở các cơ quan: Não, hạch ruột, ruột non, ruột già, phổi, hạch phổi… ngâm trong formol 10% để làm tiêu bản kiểm tra biến đổi bệnh lý vi thể.
Phương pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể: Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể được lấy mẫu ngâm trong dung dịch formol 10% để làm tiêu bản xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh. Tiêu bản vi thể được làm theo
38
phương pháp của Prophet (1992) bao gồm các bước: (1) Lấy mẫu; (2) khử nước, làm trong; (3) tẩm parafin; (4) đúc block; (5) cắt dán mảnh; (6) nhuộm Hematoxilin và Eosin; (7) gắn lamen, dán nhãn và đọc kết quả bằng kính hiển vi (Prophet & Pathology, 1992) và chụp ảnh bằng máy ảnh gắn trên kính hiển vi.