Phần 3 Nội dung và Phương pháp nghiên cứu
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.2. Phương pháp nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng virus Care
3.3.2.1. Thiết kế thí nghiệm
a. Nghiên cứu lựa chọn động vật sử dụng cho chế tạo kháng thể
Trong nghiên cứu này, hai đối tượng vật nuôi được sử dụng để gây tối miễn dịch là chó và thỏ. Nhóm 1 gồm chó 02 tháng tuổi, giống Becgie lai, khỏe mạnh. Số lượng 05 con. Nhóm 2 gồm thỏ 02 tháng tuổi, giống Newzealand, khỏe mạnh. Số lượng 05 con. Chó âm tính với kháng thể Care, Thỏ âm tính với virus gây xuất huyết thỏ. Sử dụng kháng nguyên virus Care nhược độc của công ty Hanvet, có hiệu giá 104.0TCID 50/ml để gây miễn dịch bằng cách tiêm dưới da với lịch trình tiêm như sau:
Thời gian tiêm Mũi tiêm Liều tiêm (ml/con) Đường tiêm Ghi chú
Ngày 0 Mũi 1 0,5 Dưới da
Ngày 7 - - - Lấy máu kiểm tra hàm lượng kháng thể Ngày 14 Mũi 2 0,5 Dưới da Lấy máu kiểm tra hàm lượng kháng thể
trước khi tiêm
Ngày 28 Mũi 3 0,5 Dưới da Lấy máu kiểm tra hàm lượng kháng thể trước khi tiêm
Ngày 42 - - - Lấy máu kiểm tra hàm lượng kháng thể Ngày 56 - - - Lấy máu kiểm tra hàm lượng kháng thể
‐ Ghi nhận các thông tin liên quan tới sức khỏe của vật nuôi.
‐ So sánh hàm lượng kháng thể của hai nhóm để lựa chọn nhóm động vật thích hợp cho sản xuất kháng thể.
b. Nghiên cứu chọn độ tuổi động vật sử dụng để tối miễn dịch thu kháng thể kháng virus Care
Động vật sử dụng là chó hoặc thỏ. Sử dụng 15 động vật khỏe mạnh chia làm 3 nhóm theo từng độ tuổi:
+ Nhóm 1: 05 con 02 tháng tuổi; + Nhóm 2: 05 con 03 tháng tuổi; + Nhóm 3: 05 con 04 tháng tuổi.
39
‐Sử dụng kháng nguyên virus Care nhược độc của công ty Hanvet, có hiệu giá 104.0TCID 50/ml để tiêm động vật nhằm mục đích tạo kháng thể.
‐Gây miễn dịch cho mỗi nhóm bằng cách tiêm 3 mũi, với liều 0,5ml/dưới da/con. Theo lộ trình sau:
Thời gian tiêm Mũi
tiêm
Liều tiêm (ml/con)
Đường
tiêm Ghi chú
Ngày 0 Mũi 1 0,5 Dưới da Ngày 14 Mũi 2 0,5 Dưới da Ngày 28 Mũi 3 0,5 Dưới da
Ngày 56 - - - Lấy máu kiểm tra kháng thể ‐Ghi nhận các thông tin liên quan tới sức khỏe của vật nuôi.
‐So sánh hàm lượng kháng thể của 03 nhóm để lựa chọn lứa tuổi động vật thích hợp cho sản xuất kháng thể.
c. Nghiên cứu quy trình tiêm động vật phù hợp sử dụng cho chế tạo kháng thể
Sau khi lựa chọn được đối tượng và độ tuổi động vật phù hợp, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các quy trình tối miễn dịch khác nhau để nhằm tìm ra quy trình miễn dịch cho hiệu giá kháng thể tốt nhất. Sử dụng 15 động vật khỏe mạnh (chó hoặc thỏ) chia làm 3 nhóm, miễn dịch với 03 quy trình khác nhau. Sử dụng kháng nguyên virus Care nhược độc của công ty Hanvet để tiêm.
Ngày Mũi tiêm Liều tiêm
(ml/con) Quy trình 01 Quy trình 02 Quy trình 03
0 Mũi 1 0.5 x x x 14 Mũi 2 0.5 x x x 28 Mũi 3 0.5 x x x 42 Mũi 4 0.5 x x x 56 Mũi 5 0.5 x x x 70 Mũi 6 0.5 - x x 84 Mũi 7 0.5 - - x
98 Lấy máu kiểm tra hàm lượng kháng thể 112 Lấy máu kiểm tra hàm lượng kháng thể 126 Lấy máu kiểm tra hàm lượng kháng thể ‐Ghi nhận các thông tin liên quan tới sức khỏe của vật nuôi.
40
‐So sánh hàm lượng kháng thể của 03 nhóm để lựa chọn quy trình tiêm thích hợp cho sản xuất kháng thể.
3.3.2.2. Phương pháp kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phản ứng Elisa
Các bước thực hiện phản ứng Elisa theo bộ kít ELISA INGEZIM MOQUILLO IgG Prod Ref: 15.CDG.K1
1. Để bộ KIT ở nhiệt độ phòng trước khi làm 1 giờ;
2. Pha loãng mẫu: 990 µl Dilution bufer: 10µl huyết thanh;
3. Nhỏ 100 µl mẫu đã pha loãng vào mỗi giếng, cả đối chứng dương và đỗi chứng âm;
4. Ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng;
5. Rửa khay 4 lần băng 300 µl/ giếng bằng dung dịch rửa 1%; 6. Loại bỏ toàn bộ dung dịch rửa trong khay;
7. Nhỏ 100 µl conjugate solution vào mỗi giếng và ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng; 8. Rửa khay 4 lần băng 300 µl/ giếng bằng dung dịch rửa 1%;
9. Nhỏ 100 µl substrate solution. Ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút; 10. Nhỏ 100 µl stop solution để dừng phản ứng;
11. Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 450 nm. 12. Đọc kết quả:
Giá trị trên máy đọc ELISA: Đối chứng dương: OD >1; Đối chứng âm: OD < 0,2;
Khi 2 giá trị trên đạt yêu cầu thì tính giá trị Cut off = OD của đối chứng dương × 0,2;
Kết quả: Giá trị của mẫu ≥ Cut off: dương tính; Giá trị của mẫu < Cut off: âm tính.
3.3.2.3. Phương pháp định lượng kháng thể kháng virus Care bằng phản ứng trung hòa
* Chuẩn bị:
41
- Virus Care: pha virus và bổ sung vào mỗi giếng 100 TCID50;
- Mẫu huyết thanh cần xác định hiệu giá: được vô hoạt bổ thể ở 560C/ 30 phút; - Dụng cụ đã được tiệt trùng: ống pha mẫu, đầu tip, pipet;
- Môi trường nuôi cấy tế bào CEF: Lactalbumin Hydrolysate bổ sung huyết thanh bào thai bê (FCS).
* Tiến hành:
‐Huyết thanh pha loãng trong môi trường nuôi cấy tế bào theo cơ số 10 hoặc cơ số 2: huyết thanh dương và huyết thanh âm, thao tác pha trên đĩa 96 giếng;
‐Virus pha trong môi trường nuôi cấy tế bào 100 TCID50/50 µl liều trung hòa: nhỏ vào mỗi giếng thí nghiệm 50 µl;
‐Điều kiện trung hòa 370C /1 giờ/ 5%CO2 (20 phút láng một lần); ‐Nuôi đĩa phản ứng 370C /1 giờ / 5%CO2;
‐Đọc kết quả hàng ngày: ngày thứ nhất CPE bắt đầu xuất hiện: tế bào vỡ vụn thành mảnh nhỏ li ti, ngày thứ 2 CPE rõ tế bào bị phá hủy cả giếng, ngày thứ 3 đọc và kết luận:
+ Phản ứng dương tính (Mẫu huyết thanh có kháng thể kháng virus Care): khi tế bào không bị phá hủy. Hiệu giá huyết thanh là độ pha loãng huyết thanh cao nhất mà ở đó vẫn còn kháng thể đặc hiệu trung hòa hết virus;
+ Phản ứng âm tính: giếng tế bào tại đó có CPE;
+ Huyết thanh thu được sẽ được tinh chế qua hệ thống siêu lọc (Tangential Flow Filtration - TFF) để loại bỏ các thành phần protein thô trong huyết thanh, chỉ giữ lại thành phần Gamaglobulin miễn dịch.
3.3.2.4. Phương pháp kiểm nghiệm kháng thể kháng virus Care
* Kiểm nghiệm chỉ tiêu vô trùng và thuần khiết
Phương pháp kiểm nghiệm chỉ tiêu vô trùng và thuần khiết được thực hiện căn cứ theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8684:2011. Những môi trường dùng để đánh giá chỉ tiêu vô trùng với vi khuẩn là môi trường thioglycollat, môi trường trypticaza đậu tương, môi trường thạch máu. Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc bằng môi trường Sabouraud. Kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết bằng việc đánh giá sự có mặt của kháng thể hoặc kháng nguyên xuất huyết thỏ. Phương pháp đánh giá căn cứ theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN8400-6:2011. Tất cả những chỉ tiêu nêu trên phải
42
đạt âm tính thì chế phẩm kháng thể mới đạt yêu cầu về kiểm nghiệm chỉ tiêu vô trùng và thuần khiết.
* Kiểm nghiệm chỉ tiêu an toàn
Kháng thể được tiêm với liều gấp 05 lần và 10 lần trên thỏ và chó. Sau 10 ngày liên tục theo dõi biểu hiện lâm sàng. Nếu chó và thỏ không có biểu hiện gì, mức độ ăn, uống và thể trạng bình thường thì kháng thể được coi là đã đạt yêu cầu về chỉ tiêu an toàn.
* Kiểm nghiệm chỉ tiêu hiệu lực
Chỉ tiêu hiệu lực được đánh giá gián tiếp qua kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phương pháp ELISA hoặc phản ứng trung hòa.