3.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ
- Các dụng cụ khám bệnh: nhiệt kế, ống nghe
- Dụng cụ, vật phẩm lấy mẫu xét nghiệm: tăm bông vô trùng, túi vô trùng đựng bệnh phẩm, nhãn ghi tên…
- Trang bị bảo hộ cho người khám, thu mẫu bệnh phẩm: găng tay, khẩu trang, áo blouse.
34
- Máy móc, thiết bị cần thiết: Tủ ấm CO2, tủ ấm thường, tủ ấp trứng, các loại tủ lạnh, máy đo pH, máy khuấy từ, máy Elisa, máy PCR, kính hiển vi các loại, pipetman các loại.
- Ngoài ra còn có các dụng cụ thông thường phục vụ cho sản xuất Vaccine như ống Valcol 15ml và 50ml, ống eppendorf 1,5 ml, ống nghiệm, bình tam giác (250, 500, 1000ml), đĩa pettri, dầu Tip các loại, đĩa 96 giếng, Pank, kéo...
* Vật liệu và hóa chất:
- Chó mắc bệnh Care ở các lứa tuổi mang tới khám tại các Bệnh viện thú y, phòng khám thú y ở Hà Nội.
- Chó 2 tháng tuổi khỏe mạnh chưa tiêm phòng Vaccine
- Thỏ 2-4 tháng tuổi khỏe mạnh không mắc bệnh truyền nhiễm.
- Test chẩn đoán nhanh bệnh Care CDV Ag (Asan Pharmaceutical Co., LTD; Hàn Quốc).
- Các chủng virus CDV-Hanvet cường độc phân lập từ mẫu bệnh phẩm chó mắc bệnh Care trong tự nhiên, được lưu giữ tại trung tâm nghiên cứu sinh phẩm công Ty Hanvet - Do công ty Hanvet cung cấp.
-Chủng virus Care nhược độc lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu sinh phẩm - công ty Hanvet.
-Chủng virus CDV-HV cường độc được phân lập tại Học viện Nông Nghiệp Việt Nam.
- Các loại môi trường kiểm tra vô trùng: thạch máu, TSB và nước thịt gan yếm khí nhập khẩu từ các hãng uy tín.
- Môi trường nuôi tế bào, gây nhiễm virus, dung dịch đếm số: MEM, M199, DMEM, LH3E, EMEM, FBS, BS, CMF Hank, TE 0.025%...
- Sinh phẩm, hóa chất cần thiết từ nhiều công ty uy tín như Meck, Sigma, Oxoid, Idexx. Dùng cho các quá trình gây nhiễm virus.
3.2.2. Phạm vi nghiên cứu
- Về đặc điểm của bệnh Care: Đề tài chỉ khảo sát những ca chó mắc bệnh Care ở các lứa tuổi được đưa đến phòng khám trên địa bàn nghiên cứu. Tỷ lệ mắc Care
35
tính được là tỷ lệ con mắc trên tổng số ca bệnh của chó được đưa đến khám trên điạ bàn nghiên cứu.
- Về quy trình chế kháng thể: chỉ nghiên cứu sản xuất kháng thể đa dòng chống bệnh Care.
- Chó bệnh được mang đến khám và điều trị tại hệ thống Bệnh Viện Thú Cảnh của Công ty Hanvet tại Hà Nội, Bệnh viện Thú y Petheath, Bệnh viện Thú y Hải Đăng, Phòng khám Thú y Hà Nội;
- Chó từ 2 tháng tuổi được nuôi thí nghiệm tại trung tâm nghiên cứu công ty Hanvet; và được nuôi tại trại thực nghiệm Khoa Thú y - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam.
- Thỏ từ 2 tháng tuổi được nuôi thí nghiệm tại Trung tâm Nghiên cứu - Công ty Hanvet.
* Số liệu và phần mềm
- Số liệu thu thập về: là chó mắc bệnh Care và chó bị chết do bệnh Care tại Bệnh Viện thú cảnh của công ty Hanvet và một số Phòng khám thú y, Bệnh viện thú y trên địa bàn nghiên cứu.
- Phần mềm sử dụng trong xử lý số liệu Excel 2007 và Minitab 16.0.
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm của bệnh Care
3.3.1.1. Phương pháp điều tra phát hiện bệnh
Điều tra phát hiện bệnh dựa vào thống kê hồ sơ bệnh án, mô tả bệnh, thống kê sinh học, phương pháp hồi cứu và phương pháp cắt ngang (điều tra theo dõi và phỏng vấn chủ vật nuôi, kết hợp theo dõi và quan sát trực tiếp). Cụ thể như sau:
* Phương pháp xác định chó mắc bệnh Care
Xác định chó bệnh được dựa vào lịch tiêm phòng vacxin, những triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh, bệnh tích điển hình như các tác giả (Appel Max Jg & cs., 1994; Frölich & cs., 2000; Martella & cs., 2002); (Trần Văn Nên & cs., 2017) đã mô tả. Mặt khác, trong phòng thí nghiệm, test chẩn đoán nhanh được dùng để xác định bệnh những con chó có các triệu chứng bệnh Care điển hình.
36
Những trường hợp chó có triệu chứng bệnh Care điển hình khi chẩn đoán bằng test chẩn đoán nhanh cho kết quả âm tính thì chúng tôi tiến hành chẩn đoán bằng phản ứng RT- PCR để loại trừ.
Tất cả những chó bị bệnh ở các lứa tuổi và các mùa trong năm, đưa đến khám tại Bệnh Viện Thú cảnh của công ty Hanvet, Bệnh viện thú y Petheath, Bệnh viện thú y Hải Đăng, Bệnh viện thú 2 vet tại Hà Nội được tiến hành kiểm tra thăm hỏi bệnh từ chủ vật nuôi và khám lâm sàng.
Trong nghiên cứu chúng tôi đã thực hiện nội dung theo các bước: Lập bệnh án theo dõi và điều trị; Lấy mẫu làm test chẩn đoán nhanh; Thống kê tổng số chó mang đến và số chó mắc bệnh Care.
* Phương pháp chẩn đoán bệnh Care bằng test CDV Ag
Nguyên tắc hoạt động của kit CDV Ag: dựa trên phương pháp sắc phổ miễn dịch (immunochromatography assay). Kháng nguyên sẽ kết hợp với kháng thể tạo thành phức chất miễn dịch. Chất đánh dấu trên kháng thể là những kim loại keo như vàng keo có màu đỏ/hồng. Sau đó, phức chất miễn dịch được đưa vào vùng phát hiện có chứa kháng thể cố định chống kháng nguyên và như vậy việc kết hợp giữa kháng thể và phức chất miễn dịch xảy ra. Lúc này xuất hiện những vạch nhuộm màu. Đọc kết quả dựa trên những vạch này.
Lấy mẫu chẩn đoán nhanh bệnh Care bằng test CDV Ag (Asan Pharmaceutical Co., LTD; Hàn Quốc) theo hướng dẫn của nhà cung cấp:
Thấm tăm bông bằng dung dịch muối NaCl 0,9%;
Phết tăm bông vào vị trí lấy mẫu: gồm rỉ mắt, mũi, phân; Cho tăm bông vào lọ có chứa sẵn dung dịch đệm để vài giây; Nhỏ dung dịch vào test thử;
Đọc kết quả sau 10- 15 phút;
Nếu chỉ có một vạch hồng xuất hiện ở vị trí C (control) trên Test thử thì phản ứng là âm tính; Nếu có hai vạch hồng xuất hiện ở vị trí (control) và T (Test) trên test thử thì phản ứng là dương tính.
37
(Mẫu âm tính; (B) Mẫu dương tính; (C & D) kết quả bị lỗi.)
Hình 3.1. Minh họa cho kết quả kiểm tra nhanh bệnh Care bằng test CDV Ag
Những con chó dùng trong nghiên cứu được thực hiện làm test chẩn đoán nhanh dưới sự đồng ý của chủ chó. Đồng thời, chủ của những con chó có biểu hiện lâm sàng đặc trưng của bệnh Care sẽ quyết định có hoặc không điều trị do quá trình điều trị kéo dài và tỷ lệ thành công không giống nhau giữa các ca bệnh. Những chó sau thời gian điều trị tiếp tục được theo dõi để kết luận điều trị thành công (hồi phục trở lại) hay thất bại (chết).
3.3.1.2. Phương pháp kiểm tra bệnh tích đại thể và vi thể ở chó bị bệnh Care
Mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể của chó được gây nhiễm theo tiêu chuẩn trong TCVN 8402: 2010 (Bộ Khoa học & Công nghệ, 2010). Mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể đối với chó chết mắc bệnh Care qua chẩn đoán lâm sàng và test thử CDV Ag có kết quả dương tính với virus Care. Sau đó lấy mẫu ở các cơ quan: Não, hạch ruột, ruột non, ruột già, phổi, hạch phổi… ngâm trong formol 10% để làm tiêu bản kiểm tra biến đổi bệnh lý vi thể.
Phương pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể: Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể được lấy mẫu ngâm trong dung dịch formol 10% để làm tiêu bản xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh. Tiêu bản vi thể được làm theo
38
phương pháp của Prophet (1992) bao gồm các bước: (1) Lấy mẫu; (2) khử nước, làm trong; (3) tẩm parafin; (4) đúc block; (5) cắt dán mảnh; (6) nhuộm Hematoxilin và Eosin; (7) gắn lamen, dán nhãn và đọc kết quả bằng kính hiển vi (Prophet & Pathology, 1992) và chụp ảnh bằng máy ảnh gắn trên kính hiển vi.
3.3.2. Phương pháp nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng virus Care
3.3.2.1. Thiết kế thí nghiệm
a. Nghiên cứu lựa chọn động vật sử dụng cho chế tạo kháng thể
Trong nghiên cứu này, hai đối tượng vật nuôi được sử dụng để gây tối miễn dịch là chó và thỏ. Nhóm 1 gồm chó 02 tháng tuổi, giống Becgie lai, khỏe mạnh. Số lượng 05 con. Nhóm 2 gồm thỏ 02 tháng tuổi, giống Newzealand, khỏe mạnh. Số lượng 05 con. Chó âm tính với kháng thể Care, Thỏ âm tính với virus gây xuất huyết thỏ. Sử dụng kháng nguyên virus Care nhược độc của công ty Hanvet, có hiệu giá 104.0TCID 50/ml để gây miễn dịch bằng cách tiêm dưới da với lịch trình tiêm như sau:
Thời gian tiêm Mũi tiêm Liều tiêm (ml/con) Đường tiêm Ghi chú
Ngày 0 Mũi 1 0,5 Dưới da
Ngày 7 - - - Lấy máu kiểm tra hàm lượng kháng thể Ngày 14 Mũi 2 0,5 Dưới da Lấy máu kiểm tra hàm lượng kháng thể
trước khi tiêm
Ngày 28 Mũi 3 0,5 Dưới da Lấy máu kiểm tra hàm lượng kháng thể trước khi tiêm
Ngày 42 - - - Lấy máu kiểm tra hàm lượng kháng thể Ngày 56 - - - Lấy máu kiểm tra hàm lượng kháng thể
‐ Ghi nhận các thông tin liên quan tới sức khỏe của vật nuôi.
‐ So sánh hàm lượng kháng thể của hai nhóm để lựa chọn nhóm động vật thích hợp cho sản xuất kháng thể.
b. Nghiên cứu chọn độ tuổi động vật sử dụng để tối miễn dịch thu kháng thể kháng virus Care
Động vật sử dụng là chó hoặc thỏ. Sử dụng 15 động vật khỏe mạnh chia làm 3 nhóm theo từng độ tuổi:
+ Nhóm 1: 05 con 02 tháng tuổi; + Nhóm 2: 05 con 03 tháng tuổi; + Nhóm 3: 05 con 04 tháng tuổi.
39
‐Sử dụng kháng nguyên virus Care nhược độc của công ty Hanvet, có hiệu giá 104.0TCID 50/ml để tiêm động vật nhằm mục đích tạo kháng thể.
‐Gây miễn dịch cho mỗi nhóm bằng cách tiêm 3 mũi, với liều 0,5ml/dưới da/con. Theo lộ trình sau:
Thời gian tiêm Mũi
tiêm
Liều tiêm (ml/con)
Đường
tiêm Ghi chú
Ngày 0 Mũi 1 0,5 Dưới da Ngày 14 Mũi 2 0,5 Dưới da Ngày 28 Mũi 3 0,5 Dưới da
Ngày 56 - - - Lấy máu kiểm tra kháng thể ‐Ghi nhận các thông tin liên quan tới sức khỏe của vật nuôi.
‐So sánh hàm lượng kháng thể của 03 nhóm để lựa chọn lứa tuổi động vật thích hợp cho sản xuất kháng thể.
c. Nghiên cứu quy trình tiêm động vật phù hợp sử dụng cho chế tạo kháng thể
Sau khi lựa chọn được đối tượng và độ tuổi động vật phù hợp, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các quy trình tối miễn dịch khác nhau để nhằm tìm ra quy trình miễn dịch cho hiệu giá kháng thể tốt nhất. Sử dụng 15 động vật khỏe mạnh (chó hoặc thỏ) chia làm 3 nhóm, miễn dịch với 03 quy trình khác nhau. Sử dụng kháng nguyên virus Care nhược độc của công ty Hanvet để tiêm.
Ngày Mũi tiêm Liều tiêm
(ml/con) Quy trình 01 Quy trình 02 Quy trình 03
0 Mũi 1 0.5 x x x 14 Mũi 2 0.5 x x x 28 Mũi 3 0.5 x x x 42 Mũi 4 0.5 x x x 56 Mũi 5 0.5 x x x 70 Mũi 6 0.5 - x x 84 Mũi 7 0.5 - - x
98 Lấy máu kiểm tra hàm lượng kháng thể 112 Lấy máu kiểm tra hàm lượng kháng thể 126 Lấy máu kiểm tra hàm lượng kháng thể ‐Ghi nhận các thông tin liên quan tới sức khỏe của vật nuôi.
40
‐So sánh hàm lượng kháng thể của 03 nhóm để lựa chọn quy trình tiêm thích hợp cho sản xuất kháng thể.
3.3.2.2. Phương pháp kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phản ứng Elisa
Các bước thực hiện phản ứng Elisa theo bộ kít ELISA INGEZIM MOQUILLO IgG Prod Ref: 15.CDG.K1
1. Để bộ KIT ở nhiệt độ phòng trước khi làm 1 giờ;
2. Pha loãng mẫu: 990 µl Dilution bufer: 10µl huyết thanh;
3. Nhỏ 100 µl mẫu đã pha loãng vào mỗi giếng, cả đối chứng dương và đỗi chứng âm;
4. Ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng;
5. Rửa khay 4 lần băng 300 µl/ giếng bằng dung dịch rửa 1%; 6. Loại bỏ toàn bộ dung dịch rửa trong khay;
7. Nhỏ 100 µl conjugate solution vào mỗi giếng và ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng; 8. Rửa khay 4 lần băng 300 µl/ giếng bằng dung dịch rửa 1%;
9. Nhỏ 100 µl substrate solution. Ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút; 10. Nhỏ 100 µl stop solution để dừng phản ứng;
11. Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 450 nm. 12. Đọc kết quả:
Giá trị trên máy đọc ELISA: Đối chứng dương: OD >1; Đối chứng âm: OD < 0,2;
Khi 2 giá trị trên đạt yêu cầu thì tính giá trị Cut off = OD của đối chứng dương × 0,2;
Kết quả: Giá trị của mẫu ≥ Cut off: dương tính; Giá trị của mẫu < Cut off: âm tính.
3.3.2.3. Phương pháp định lượng kháng thể kháng virus Care bằng phản ứng trung hòa
* Chuẩn bị:
41
- Virus Care: pha virus và bổ sung vào mỗi giếng 100 TCID50;
- Mẫu huyết thanh cần xác định hiệu giá: được vô hoạt bổ thể ở 560C/ 30 phút; - Dụng cụ đã được tiệt trùng: ống pha mẫu, đầu tip, pipet;
- Môi trường nuôi cấy tế bào CEF: Lactalbumin Hydrolysate bổ sung huyết thanh bào thai bê (FCS).
* Tiến hành:
‐Huyết thanh pha loãng trong môi trường nuôi cấy tế bào theo cơ số 10 hoặc cơ số 2: huyết thanh dương và huyết thanh âm, thao tác pha trên đĩa 96 giếng;
‐Virus pha trong môi trường nuôi cấy tế bào 100 TCID50/50 µl liều trung hòa: nhỏ vào mỗi giếng thí nghiệm 50 µl;
‐Điều kiện trung hòa 370C /1 giờ/ 5%CO2 (20 phút láng một lần); ‐Nuôi đĩa phản ứng 370C /1 giờ / 5%CO2;
‐Đọc kết quả hàng ngày: ngày thứ nhất CPE bắt đầu xuất hiện: tế bào vỡ vụn thành mảnh nhỏ li ti, ngày thứ 2 CPE rõ tế bào bị phá hủy cả giếng, ngày thứ 3 đọc và kết luận:
+ Phản ứng dương tính (Mẫu huyết thanh có kháng thể kháng virus Care): khi tế bào không bị phá hủy. Hiệu giá huyết thanh là độ pha loãng huyết thanh cao nhất mà ở đó vẫn còn kháng thể đặc hiệu trung hòa hết virus;
+ Phản ứng âm tính: giếng tế bào tại đó có CPE;
+ Huyết thanh thu được sẽ được tinh chế qua hệ thống siêu lọc (Tangential Flow Filtration - TFF) để loại bỏ các thành phần protein thô trong huyết thanh, chỉ giữ lại thành phần Gamaglobulin miễn dịch.
3.3.2.4. Phương pháp kiểm nghiệm kháng thể kháng virus Care
* Kiểm nghiệm chỉ tiêu vô trùng và thuần khiết
Phương pháp kiểm nghiệm chỉ tiêu vô trùng và thuần khiết được thực hiện căn cứ theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8684:2011. Những môi trường dùng để đánh giá chỉ tiêu vô trùng với vi khuẩn là môi trường thioglycollat, môi trường trypticaza đậu tương, môi trường thạch máu. Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc bằng môi trường Sabouraud. Kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết bằng việc đánh giá sự có mặt của kháng thể hoặc kháng nguyên xuất huyết thỏ. Phương pháp đánh giá căn cứ theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN8400-6:2011. Tất cả những chỉ tiêu nêu trên phải
42
đạt âm tính thì chế phẩm kháng thể mới đạt yêu cầu về kiểm nghiệm chỉ tiêu vô trùng và thuần khiết.
* Kiểm nghiệm chỉ tiêu an toàn
Kháng thể được tiêm với liều gấp 05 lần và 10 lần trên thỏ và chó. Sau 10 ngày liên tục theo dõi biểu hiện lâm sàng. Nếu chó và thỏ không có biểu hiện gì, mức độ ăn, uống và thể trạng bình thường thì kháng thể được coi là đã đạt yêu cầu về chỉ tiêu an toàn.
* Kiểm nghiệm chỉ tiêu hiệu lực
Chỉ tiêu hiệu lực được đánh giá gián tiếp qua kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phương pháp ELISA hoặc phản ứng trung hòa.
3.3.3. Phương pháp gây bệnh thực nghiệm và điều trị thực nghiệm
3.3.3.1. Thiết kế thí nghiệm
Động vật thí nghiệm gồm 20 con, chó 2 tháng tuổi có trọng lượng từ 2- 3 kg/con.Chó thí nghiệm được chọn là chó không mắc virus Care và các virus khác (bệnh Parvovirus, bệnh viêm gan truyền nhiễm....) và không có kháng thể kháng virus Care.
Hai mươi chó thí nghiệm được chia thành 4 lô: