Phần 4 Kết quả và Thảo luận
4.1. Kết quả xác định một số đặc điểm của bệnh Care
4.1.2. Kết quả kiểm tra chó mắc Care bằng test chẩn đoán nhanh CDV-Ag
4.1.2.1. Kết quả kiểm tra bằng test chẩn đoán nhanh
Chó mang tới khám tại các cơ sở nghiên cứu với những biểu hiện triệu chứng lâm sàng điển hình của bệnh. Các mẫu swab mắt, mũi và phân của chó bệnh được sử dụng để xác định sự có mặt của virus Care bằng bộ kit chẩn đoán nhanh CDV-Ag (Asan Pharm, Hàn Quốc) để khẳng định bệnh theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Những ca bệnh có triệu chứng điển hình của bệnh Care mà kit chẩn đoán nhanh cho kết quả âm tính thì chúng tôi làm xét nghiệm RT-PCR để kiểm tra độ nhạy của kit.
Kết quả dương tính khi xuất hiện hai vạch màu đỏ vị trí T (test line) và C (control line) (Hình 4.1).
50
(H 1.2.5. Vạch Test (++), 3 Vạch Test (+), 4. Vạch Test (+++), 6. Hình ảnh của test. 7. Kết quả Test (-)
Hình 4.1. Hình ảnh một số kết quả thử nghiệm nhanh bằng test CDV-Ag
1 2
5 4
3
51
Kết quả ở hình 4.1 cho thấy các mẫu test CDV-Ag nhanh cho hình ảnh không hoàn toàn giống nhau do các mẫu thử nghiệm được lấy ở các vị trí khác nhau (mẫu swab mắt và mũi, và mẫu phân) có tải lượng virus không đồng nhất nên kết quả phản ánh những mẫu dương tính cũng có sự khác nhau. Điều này cho thấy sự có mặt của virus ở các cơ quan, bộ phận của chó mắc Care là không giống nhau. Có mẫu dương tính (+++) là mẫu số 4 nhưng có mẫu chỉ ở mức dương tính (++) là các mẫu số 1, 2, 5 hoặc chỉ dương tính ở mức (+) là mẫu số 3.
Mức độ dương tính của bệnh thể hiện (+), (++), hay (+++) đánh giá bằng thời gian xuất hiện của vạch thứ 2 (Test line) và độ đậm nhạt của màu vạch. Từ kết quả này có thể đánh giá được thời gian mắc bệnh, nồng độ virus trong cơ thể chó mắc bệnh, điều này phù hợp với nghiên cứu của các tác giả (Pratakpiriya & cs., 2012).
Mẫu đối chứng âm không có virus chỉ xuất hiện một vạch màu đỏ ở vị trí (Control line) (hình 7).
4.1.2.2. Kết quả xác định tỷ lệ chó bị bệnh do virus Care bằng kit CDV-Ag
Kết quả thử nghiệm test CDV-Ag được trình bày ở bảng 4.2. Số chó mắc bệnh Care có triệu chứng điển hình trên nhóm chó ngoại là 354 ca, trên nhóm chó nội là 221 ca. Tổng số mẫu được thử bằng phương pháp kít chẩn đoán nhanh là 391 mẫu (từ năm 2013 - 2018), mẫu đại diện trên cả hai đối tượng là chó nội và chó ngoại nhiễm virus Care.
Bảng 4.2. Kết quả kiểm tra chó mắc Care bằng test chẩn đoán nhanh CDV Ag Năm Nhóm chó ngoại Nhóm chó nội Số chó mắc Số làm test Số dương tính Tỷ lệ (%) Số chó mắc Số làm test Số dương tính Tỷ lệ (%) 2013 65 51 45 88,24 53 22 20 90,91 2014 69 48 43 89,58 47 20 18 90.01 2015 52 42 40 95,24 36 11 9 81,82 2016 62 57 54 94,74 27 17 14 82,35 2017 54 45 41 91,11 32 19 17 89,47 2018 52 44 40 90,91 26 15 13 86,67 Tổng 354 287 263 91,64 221 104 91 87,50 Qua bảng 4.2 cho thấy trong số 391 mẫu làm tets nhanh có 287 mẫu ở nhóm chó ngoại và 104 mẫu ở nhóm chó nội. Tỷ lệ mẫu làm test cho kết quả dương tính với CDV- Ag cao. Ở các giống chó ngoại tỷ lệ dương tính với test CDV- Ag
72
trước khi phối trộn sản phẩm. Huyết thanh sau khi xử lý vô trùng bằng phương pháp lọc, sẽ được cô đặc bằng hệ thống lọc tiếp tuyến (TFF). Hệ thống lọc tiếp tuyến giúp giảm thể tích huyết thanh, tăng hiệu giá kháng thể, loại bỏ bớt các protein thô có kích thước lớn hơn 300 kda, giảm không gian lưu trữ... Tuy nhiên, đây là công nghệ mới và hiện đại, cần tối ưu quá trình theo hướng dẫn của nhà sản xuất, xác định hiệu suất cô đặc. Ở đây, chúng tôi tiến hành thí nghiệm cô đặc 4 lần, 8 lần, 16 lần.
- Sơ đồ lắp đặt hệ thống lọc tiếp tuyến:
Hình 4.10. Sơ đồ lắp đặt hệ thống TFF
73
Kết quả cô đặc huyết thanh bằng hệ thống lọc TFF được trình bày ở bảng 4.8
Bảng 4.8. Kết quả cô đặc huyết thanh bằng hệ thống lọc TFF
Mô tả Lô TN
Thời gian TB
(phút)
Trước khi lọc Sau khi lọc
Thể tích (ml) HGKT (log2) Thể tích (ml) HGKT (log2) Cô đặc 4 lần 1 70 4000 8 1020 10 2 4000 9 1100 10 3 4000 9 1040 11 Trung bình 4000 8.67 1053 10,33 Cô đặc 8 lần 1 155 8000 9 1030 12 2 8000 9 1040 12 3 8000 9 1030 12 Trung bình 8000 9.00 1033 12 Cô đặc 16 lần 1 320 16000 10 960 14 2 16000 9 970 14 3 16000 9 980 13 Trung bình 16000 9.33 970 13,67
Từ bảng kết quả trên cho thấy: Hiệu giá kháng thể tăng tương ứng với số lần cô đặc, nước thải của quá trình lọc cô đặc kiểm tra không phát hiện có kháng thể Care. Như vậy hiệu suất lọc ở các mức cô đặc khác nhau đều đạt hiệu suất 100%.
Mức độ cô đặc càng cao thì thời gian để cô đặc càng nhiều.
Do hiệu suất cô đặc là như nhau nên tùy vào mục đích sử dụng để bảo quản, phối trộn để để tính toán thể tích cô đặc 4 lần, 8 lần hay 16 lần.
4.2.2.2. Sản xuất thử nghiệm kháng thể kháng virus Care quy mô Pilot
Sau khi nghiên cứu được các thông số tối ưu cho quy trình tối miễn dịch trên thỏ thu kháng thể Care, chúng tôi đã tiến hành sản xuất thử nghiệm 03 lô kháng thể Care ở quy mô pilot. Số lượng 30 thỏ/1 lô sản xuất.
Lô số 1 (0116), Lô số 2 (0216), Lô số 3 (0316). Số huyết thanh thu được ở lô 1 là: (1.350 ml), lô 2 là: (1.320 ml), lô 3 là: (1.400 ml).
74
Bảng 4.9. Kết quả thử nghiệm chế tạo kháng thể Care quy mô Pilot
Lô sản xuất Số thỏ miễn dịch (con) Số con thỏ sống (con) Số con thu huyết thanh (con) Lượng huyết thanh thu (ml) HGKT (log2) Lô 0116 30 30 30 1350 10 Lô 0216 30 29 29* 1320 10 Lô 0316 30 30 30 1400 11
Ghi chú: (*) có 01 thỏ bị chết sau mũi tiêm số 6, mổ khám không có bệnh tích.
Kết quả bảng 4.9 cho thấy: Cả 03 lô sản xuất thử nghiệm: thỏ đều phát triển tốt, cho đáp ứng miễn dịch đồng đều. Hiệu giá kháng thể trong huyết thanh thu được đạt 10 - 11 log2. Bán thành phẩm sau khi tinh chế, được bổ sung thêm chất bảo quản Thiomersano, tính toán hiệu giá kháng thể để phối trộn và ra chai.
4.2.2.3. Kiểm nghiệm sản phẩm kháng thể Care
Sản phẩm kháng thể phải đạt các tiêu chuẩn về vô trùng, độ thuần khiết, tính an toàn và hiệu giá kháng thể đáp ứng miễn dịch. Kết quả ở bảng 4.10.
Bảng 4.10. Kết quả ra chai và kiểm nghiệm 03 lô sản phẩm kháng thể Care
Lô sản xuất Quy cách
(ml/lọ) Số lọ
Kết quả kiểm nghiệm thành phẩm Vô
trùng
Thuần
khiết* An toàn Hiệu giá
KT.Care 01 3 680 Đạt Đạt Đạt 9log2
KT.Care 02 3 630 Đạt Đạt Đạt 9log2
KT.Care 03 3 750 Đạt Đạt Đạt 9log2
Ghi chú: *: Không tạp nhiễm virus xuất huyết truyền nhiễm thỏ
Kết quả sản phẩm đạt yêu cầu về độ vô trùng (không tạp nhiễm vi khuẩn, nấm), thuần khiết (không tạp nhiễm virus gây xuất huyết truyền nhiễm thỏ), độ an toàn cao (tiêm thí nghiệm trên chó thấy động vật không có phản ứng phụ, khỏe mạnh bình thường) và hiệu giá kháng thể đạt được là 9log2.
4.3. KẾT QUẢ GÂY BỆNH THỰC NGHIỆM VÀ ĐIỀU TRỊ THỬ NGHIỆM 4.3.1. Kết quả gây bệnh thực nghiệm 4.3.1. Kết quả gây bệnh thực nghiệm
Động vật thí nghiệm gồm 20 con chó 2 tháng tuổi có trọng lượng từ 2- 3 kg/con. Chó thí nghiệm được chọn là chó không mắc bệnh do virus Care và các
75
virus khác(bệnh Parvovirus, bệnh viêm gan chó...)và không có kháng thể kháng virus Care.
Bố trí thí nghiệm: 20 conchó được chia thành 4 lô:
+ Lô Thí nghiệm 1: 5 con được gây nhiễm bằng virus Care chủng CDV-HV và điều trị bằng phác đồ 1.
+ Lô Thí nghiệm 2: 5 con được gây nhiễm bằng virus Care chủng CDV-HV và điều trị bằng phác đồ 2.
+ Lô thứ 3 (Đối chứng dương ): 5 con được gây nhiễm bằng virus Care chủng CDV-HV và không điều trị để nghiên cứu đặc điểm bệnh lý.
+ Lô thứ 4 (đối chứng âm): 5 con, chó được nuôi bình thường không gây nhiễm virus.
Các lô thí nghiệm và đối chứng được nuôi ở các chuồng khác nhau ở khu nuôi động vật thí nghiệm đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học cấp 2 của khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Kết quả thu được như sau:
4.3.1.1. Thời gian virus xuất hiện trong máu, dịch mắt, mũi và trong phân
Sau khi gây bệnh thực nghiệm cho chó bằng chủng virus Care (CDV-HV), các mẫu máu, dịch swab (nhử mắt, nhử mũi) và phân của chó thí nghiệm và đối chứng được thu vào ngày thứ 1, 3, 5, 7. Kết quả đánh giá sự có mặt của virus Care bằng phương pháp RT - PCR được trình bày ở bảng 4.11a và 4.11b.
Bảng 4.11a. Kết quả xét nghiệm virus Care bằng phương pháp RT – PCR
Ngày sau gây
nhiễm
Số mẫu dương tính/ Số mẫu kiểm tra Lô thí nghiệm 1 (n = 5)
Chó được gây nhiễm bằng virus Care chủng CDV-HV và điều trị
bằng phác đồ 1
Lô thí nghiệm 2 (n = 5)
Chó được gây nhiễm bằng virus Care chủng CDV-HV và điều trị
bằng phác đồ 2
Máu Swab Phân Máu Swab Phân
1 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
3 5/5 0/5 0/5 5/5 0/5 0/5
5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
76
Kết quả cho thấy ở bảng 4.11a lô gây bệnh thí nghiệm có dùng phác đồ điều trị ngày thứ nhất gây nhiễm chưa có virus xuất hiện, đến ngày thứ 3 xuất hiện trong máu của chó thí nghiệm ở cả hai phác đồ điều trị. Đến ngày thứ 5 và ngày thứ 7 sau điều trị, chó ở cả lô 1 và lô 2 đều không còn virus.
Bảng 4.11b. Kết quả xét nghiệm virus Care bằng phương pháp RT - PCR
Ngày sau gây nhiễm
Số mẫu dương tính/ Số mẫu kiểm tra Lô Đối Chứng Dương 3 (n = 5)
Được gây nhiễm bằng virus Care chủng CDV-HV và không điều trị
Lô Đối Chứng Âm 4 (n = 5)
Không gây nhiễm - không điều trị
Máu Swab Phân Máu Swab Phân
1 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
3 5/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
5 5/5 5/5 5/5 0/5 0/5 0/5
7 5/5 5/5 5/5 0/5 0/5 0/5
Ở bảng 4.11b lô đối chứng dương và đối chứng âm, cho thấy lô đối chứng dương ở ngày 1 chưa thấy xuất hiện virus, ngày thứ 3 sau gây nhiễm thấy virus xuất hiện ở máu. Ngày thứ 5 và thứ 7 sau gây nhiễm virus xuất hiện cả trong máu, dịch Swab và trong phân của chó. Ở lô 4 chó khỏe mạnh bình thường, kiểm tra không có virus Care trong máu.
Kết quả gây nhiễm này phù hợp với các triệu chứng ghi được ở chó được gây nhiễm bằng virus Care chủng CDV-HV thực nghiệm. Sau gây nhiễm chó có các biểu hiện lâm sàng như: sốt, có dịch dử mắt, mũi, ho, khó thở, giảm ăn, tiêu chảy... Tất cả đều có hiện tượng sốt lên xuống, sốt nhẹ vào ngày thứ 3 (39oC), sốt kéo dài đến ngày thứ 5 (40oC), sau đó nhiệt độ hạ xuống gần bình thường, các triệu chứng lâm sàng khác là giảm ăn, ủ rũ mệt mỏi, nôn mửa, ho, khó thở, có dịch dử mắt dịch mũi, ỉa chảy. Hiện tượng tăng hô hấp là để thải bớt nhiệt khi con vật bị sốt cao.
Ngoài ra, do virus Care tấn công và nhân lên ở các mô lympho và niêm mạc của hệ hô hấp nên gây viêm phổi kẽ; kết hợp với sự phá vỡ các đại thực bào phế nang là sự kế phát của các mầm bệnh trong đường hô hấp, từ đó gây ra các triệu chứng bệnh tích điển hình nhất ở phổi.
Như vậy, khi gây nhiễm thực nghiệm bởi chủng virus CDV-HV chúng tôi thấy chó có những biểu hiện bệnh lý đặc trưng của bệnh Care.
- Đối với lô đối chứng âm không gây nhiễm virus, không có biểu hiện gì khác thường, chó hoàn toàn khỏe mạnh.
77
4.3.1.2. Kết quả kiểm tra phát hiện virus Care trên chó gây bệnh thí nghiệm bang phương pháp RT-PCR
Mẫu máu, dịch swab (nhử mắt, mũi) và phân của chó thí nghiệm được sử dụng để kiểm tra xác định sự có mặt của virus Care bằng phương pháp RT- PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu với chủng virus Care.
Kết quả được thế hiện ở hình 4.12.
Ghi chú: M: (Marker) thang chuẩn 100 bp; Thứ tự giếng 1,2 3 là mẫu máu; giếng 4, 5, 6 là mẫu dịch swab; giếng 7, 8,9 là mẫu phân của 3 chó gây nhiễm chủng virus Care (CDV-HV), giếng 10 là đối chứng
âm; giếng 11 là đối chứng dương.
Hình 4.12. Kết quả điện di thực hiện phản ứng RT-PCR sau 5 ngày gây nhiễm CDV-HV
Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR với đoạn gene P được trình bày ở hình 4.12 với một băng sáng duy nhất tương ứng với kích thước là 429 bp. Điều này cho thấy các bước tách chiết ARN tổng số, thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR đã được tối ưu.
Từ bảng 4.11a; bảng 4.11b và kết quả xét nghiệm CDV-HV bằng phương pháp RT – PCR cho thấy: M 1 2 3 4 5 6 100bp 200bp 300bp 500bp 400bp 429 bp M 7 8 9 10 11
78
Ở ngày thứ nhất sau gây nhiễm chưa phát hiện thấy virus, có lẽ do số lượng virus nhân lên chưa đủ để phát hiện. Ở ngày thứ 3 sau khi gây nhiễm, cả 15 chó của 3 lô gây nhiễm đều cho kết quả dương tính, virus đã xuất hiện trong máu nhưng chưa thấy virus trong dịch swab và phân.
Đến ngày thứ 5 và ngày thứ 7 thì cả 5 chó của 2 lô đối chứng dương đều thấy virus trong máu, dịch swab và phân. Khi có sự xuất hiện của virus trong 2 lô cho điều trị theo 2 phác đồ (Lô 1 điều trị theo phác đồ 1, Lô 2 điều trị theo phác đồ 2, kháng thể kháng virus Care. Sau 3 ngày gây nhiễm cho điều trị, kiểm tra không phát hiện được virus trong các lô thí nghiệm 1 và lô thí nghiệm 2. Chó của lô đối chứng âm ở cả 3 lần lấy mẫu (ngày thứ 3, 5 và 7) đều cho kết quả âm tính (-).
Từ những kết quả trên chứng minh quá trình gây nhiễm thành công cho chó thí nghiệm bằng virus Care chủng CDV-HV. Ở các lô thí nghiệm được điều trị bằng kháng thể kháng virus Care, cho thấy sau khi sử dụng, kháng thể đã có tác dụng trung hòa virus nên không phát hiện được virus trong máu và trong phân ở các ngày lấy mẫu thứ 5 và thứ 7.
4.3.1.3. Kết quả nghiên cứu các chỉ tiêu lâm sàng của chó thí nghiệm
a. Kết quả xác định thân nhiệt
Trong thí nghiệm, hàng ngày chúng tôi tiến hành kiểm tra đo thân nhiệt của chó. Kiểm tra thân nhiệt là một trong những khâu quan trọng không thể thiếu được trong chẩn đoán lâm sàng. Căn cứ vào nhiệt độ của cơ thể có thể thấy phần nào mức độ ảnh hưởng của bệnh với cơ thể chó và phản ứng đáp ứng của chó với bệnh đó.
Sau 3 ngày gây bệnh thực nghiệm, chó bắt đầu có biểu hiện đầu tiên là sốt, có cá thể sốt cao nhất là 40,3oC. Hiện tượng sốt biểu hiện ở cả 5 chó gây nhiễm.
Theo dõi thân nhiệt của chó qua từng ngày sau khi gây bệnh thực nghiệm, kết quả được thể hiện ở Bảng 4.12.
79
Bảng 4.12. Biến động thân nhiệt của chó sau khi được gây bệnh với chủng CDV-HV và điều trị thực nghiệm bằng chế phẩm kháng huyết thanh Care
Ngày
Điều trị phác đồ 1 Điều trị phác đồ 2 Không điều trị
Lô TN 1 n = 5 x m X Lô TN2 n = 5 x m X Lô TN3 n = 5 x m X Lô ĐC n = 5 x m X 1 38,5 ± 0,05 38,7 ± 0,11 38,6 ± 0,10 38,8 ± 0,04 2 39,8 ± 0,02 39,7 ± 0,04 39,8 ± 0,04 38,5 ± 0,04 3 41,4 ± 0,04 41,5 ± 0,03 40,8 ± 0,03 38,6 ± 0,03 4 40,4 ± 0,04 39,5 ± 0,08 41,4 ± 0,12 38,6 ± 0,04