4.11a Kết quả xét nghiệm virus Care bằng phương pháp RT-PCR
4.16. Bệnh tích đại thể của chó được gây nhiễm CDV-HV
Ở chó TN1 và TN2 bệnh tích xuất hiện ở gan có xuất huyết, gan sưng to, túi mật sưng ở chó TN3 và TN4. Bệnh tích thận tập trung xuất hiện xuất huyết ở 3 chó TN1, TN3, TN4. Đối với chó TN2 chúng tôi thấy thận thay đổi kích thước lớn hơn.
89
Bệnh tích ở não chủ yếu là xuất huyết, sung huyết ở những vị trí không đồng nhất trên não ở 5 chó thí nghiệm.
4.3.1.7. Bệnh tích vi thể chủ yếu của chó được gây nhiễm CDV-HV
Với chó thí nghiệm, sau khi mổ khám quan sát được các biến đổi đại thể, chúng tôi tiến hành lấy mẫu các cơ quan: phổi, lách, hạch lympho, thận, ruột, gan, não ngâm bảo quản formalin 10% sau đó làm tiêu bản vi thể. Bệnh tích vi thể của chó thí nghiệm được trình bày ở bảng 4.17.
Bảng 4.17. Bệnh tích vi thể chủ yếu của chó được gây nhiễm CDV-HV thực nghiệm Cơ quan chó Phổi Hạch lympho xuất huyết Lách nhồi huyết Gan sung huyết, thoái hóa mỡ Thận viêm, xuất huyết Ruột sung huyết, lông nhung đứt nát Não sung huyết, thâm nhiễm tế bào viêm Viêm kẽ Xuất huyết, sung huyết Phế quản phế viêm TN1 + + + + + + + + + TN2 + + + + - + + + + TN3 + + + + - + + + + TN4 + + + + + + + + + TN5 + + + + + + + + + ĐC1 - - - - - - - - - ĐC2 - - - - - - - - - ĐC3 - - - - - - - - - ĐC4 - - - - - - - - - ĐC5 - - - - - - - - - Ghi chú: + Có bệnh tích; - Không có bệnh tích
Kết quả bảng 4.17 cho thấy các biến đổi vi thể quan sát được ở các cơ quan của chó mắc bệnh do virus CDV-HV là rõ rệt.
Trên cả 5 chó thí nghiệm đều quan sát thấy viêm phổi, xuất huyết, phế quản phế viêm.
Trong lòng phế quản và phế nang chứa đầy tế bào viêm, nước phù và hồng cầu, vách phế nang giãn rộng, mạch quản sung huyết. Lòng phế nang hẹp lại.
Chó bệnh có hiện tượng viêm kẽ phổi tăng sinh các tế bào đại thực bào và tế bào lymphocyte nằm trong kẽ phổi đồng thời phổi xuất hiện tế bào xơ non.
90
Trong lòng phế quản chứa đầy BCĐNTT thoái hoá hoặc không thoái hoá, ĐTB, tế bào biểu mô long ra. Vách phế quản sung huyết, thâm nhiễm BCĐNTT có khi tập trung thành từng đám lớn che khuất cả cấu trúc phế quản. Ngoài ra chúng tôi còn tìm thấy thể vùi trong nguyên sinh chất những tế bào bị virus phá huỷ.
Phổi xuất huyết rõ, lòng phế quản và phế nang chứa đầy hồng cầu màu đỏ tươi. Ruột bị viêm cata xuất hiện trên cả 5 con, có sự thâm nhiễm của tế bào plasmocyte. Do sự tấn công làm cho lông nhung bị đứt nát và xếp lộn xộn hoại tử dẫn đến xơ hóa.
Theo Watson & Wright (1974), khi chó mắc bệnh Care tế bào biểu mô không tràng bị thoái hóa, hoại tử. Quan sát bệnh tích hạch lympho trên 5 chó chúng tôi thấy các hạch lympho đều sung huyết, xuất huyết vùng rìa hạch, có các điểm thoái hóa và hoại tử tế bào. Quan sát 2 cho TN1 và TN4 thấy lách sung huyết, thoái hoá và hoại tử. Trên tiêu bản lách thấy vách đứt nát, các tế bào thoái hoá xen kẽ với các tế bào lành, thâm nhiễm hồng cầu lan tràn trong nhu mô lách, tế bào lympho giảm.
Thận ngoài những biến đổi bệnh lý như thâm nhiễm tế bào viêm, kẽ thận xuất huyết. Cầu thận viêm có chứa dịch rỉ viêm, tế bào ống thận teo nhỏ, lòng ống rộng, có trụ trong. Ở các vùng lành có hoạt động bù, mạch quản giãn rộng, tế bào ống thận to hơn bình thường.
Bệnh tích vi thể ở não cho thấy, sung huyết mạch quản não và thâm nhiễm tế bào viêm xung quanh mạch quản não, xuất hiện thể vùi trong tế bào thần kinh (neuron). Theo Watson & Wright (1974), xuất hiện thể vùi (intranuclear inclusion body) ở tế bào biểu mô, tế bào lưới, tế bào lympho, tế bào thần kinh đệm và tế bào thần kinh là bệnh tích vi thể điển hình của bệnh Care. Tế bào gan thoái hóa mỡ, thoái hóa không bào, thâm nhiễm nhiều tế bào viêm ở quãng cửa.
Các kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả như Blixenkrone-Møller (1993); Appel Max & cs. (1994); Harder & Osterhaus (1997); Lan & cs. (2005, 2006, 2009); Greene & Carmichael (2013) đã công bố.
4.3.1.8. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch của các cơ quan
Để kiểm tra sự có mặt của virus trong các mô của chó gây nhiễm, chúng tôi đã dùng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC). Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên tắc của sự kết hợp giữa kháng
91
nguyên và kháng thể cho phép phát hiện kháng nguyên tồn tại trong tổ chức, và được phát hiện bằng chất chỉ thị màu. Kết quả cho thấy virus tập trung chủ yếu ở tế bào biểu mô phế quản, phế nang và các hạch lympho (hình 4.18).
Ghi chú: a. Phổi xuất huyết (đầu mũi tên), thâm nhiễm tế bào viêm lòng phế nang (mũi tên), HE.x100; b. Thâm nhiễm tế bào viêm ở ruột (mũi tên), HE.x200; c. Tế bào viêm thâm nhiễm xung quanh mạch máu
não (mũi tên), HE.x200; d. Thể vùi (intranuclear inclusion body) của virus Care xuất hiện ở não (mũi
tên), HE.x400; e. Tế bào biểu mô nhánh cuống phổi nhỏ dương tính với kháng thể CDV, IHC.x200; f. Tế bào biểu mô nhánh cuống phổi lớn dương tính với kháng thể CDV, IHC.x400.
Hình 4.17. Hình ảnh vi thể các tổ chức tế bào ở chó gây nhiễm Care thực nghiệm chủng CDV - HV
Tế bào biểu mô nhánh cuống phổi nhỏ dương tính với kháng thể CDV, IHC. × 200; f. Tế bào biểu mô nhánh cuống phổi lớn dương tính với kháng thể CDV, IHC. × 400). Từ kết quả nghiên cứu này cho thấy lấy mẫu phổi và hạch phổi cho phép phát hiện virus nhanh hơn và nhậy hơn trong chẩn đoán bệnh (Bảng 4.18).
92
Bảng 4.18. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch của các cơ quan
Phổi Hạch lympho Ruột Não
Chó thí nghiệm +++ +++ ++ +
Chó đối chứng - - - -
Ghi chú: +++ đám hạt bắt màu nâu nhiều và rõ, ++ hạt màu nâu trung bình, + hạt màu nâu nhỏ, ít, - không có các hạt màu nâu
Kết quả Bảng 4.18 cho thấy:
- Ở phổi của chó thí nghiệm, kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch tiêu bản phổi phát hiện virus tập trung nhiều nhất trong đại thực bào của vùng phổi, trong tế bào biểu mô vách phế quản và phế nang. Điều này phù hợp với các biến đổi bệnh lý vi thể đặc trưng của phổi bị nhiễm virus gây viêm kẽ phổi lan tỏa với sự dày lên của vách phế nang và sự tăng sinh của biểu mô vách phế nang. Vách phế nang, phế quản có chứa nhiều các thể vùi.
- Ở ruột, do virus tập trung chủ yếu ở tế bào biểu mô ruột dẫn đến các tuyến ruột cũng có nhiều virus khu trú. Trong thành ruột có những chỗ lông nhung bị đứt nát do virus tập trung nhiều. Ngoài ra, virus còn tập trung ở lớp cơ vòng và cơ dọc. Virus tấn công đã làm hoại tử tế bào biểu mô ruột và tăng sinh các nang hạch lympho.
- Tại hạch lympho, kháng nguyên phân bố lan tràn không tập trung. Virus gây suy giảm và hoại tử tế bào lympho ở các hạch lympho.
- Ở não các tế bào nơ-ron thần kinh bị thoái hóa, có hiện tượng demyelination encephalitis (hiện tượng viêm não bong lớp vỏ myelin) ở phần chất trắng của tiểu não.
- Tổn thương trên da như viêm da mụn nước và mụn mủ có thể xảy ra do quá trình tăng sừng hóa với sự xuất hiện các mụn nước và mụn mủ có thể được tìm thấy ở chó mắc bệnh. Sự có mặt của virus Care trong biểu bì ở gan bàn chân của chó mắc Care liên quan tới sự phát triển của các tế bào sản sinh keratin dẫn đến hiện tượng sừng hóa.
4.3.1.9. Kết quả bước đầu điều trị thử nghiệm chó gây nhiễm virus Care
Trong bố trí thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm chúng tôi đã sử dụng chế phẩm kháng thể kháng virus Care chế được, điều trị thử nghiệm 2 lô bằng 2 phác
93
đồ: Lô thí nghiệm1 (TN1) dùng phác đồ 1, lô thí nghiệm 2 (TN2) dùng phác đồ 2. Kết quả được chúng tôi trình bày ở bảng 4.19.
Bảng 4.19. Kết quả bước đầu điều trị thử nghiệm chó gây nhiễm virus Care
Lô Số điều trị Số khỏi Tỷ lệ (%) P-value
TN1 5 4 80a
0,417
TN2 5 3 60a
Tổng 10 7 70a
Trong cùng một cột các giá trị tỷ lệ mang chữ cái giống nhau, sai khác không có ý nghĩa thống kê(P>0,05)
Sau 21 ngày theo dõi thí nghiệm, dựa trên các chỉ tiêu lâm sàng cho thấy số chó khỏi bệnh là (80 %) ở phác đồ 1 và (60%) ở phác đồ 2. Kết quả cho thấy ở cả 2 phác đồ đều có những các thể bị tử vong do điều trị không có kết quả. Với số con sống sót vẫn có một tỷ lệ bị còi cọc cụ thể ở cả 2 lô có 7 con khỏi thì 3 con còi cọc kém phát triển. Ở lô 1 có 4 con khỏi trong 5 con điều trị thì 2 con còi cọc, lô 2 có 3 con khỏi có 1 con còi cọc.
Điều đó cho thấy, kháng thể đã có tác dụng nhưng để lựa chọn được phác đồ điều trị tối ưu cần phải điều trị thực nghiệm ở quy mô pilot.
4.3.2. Kết quả nghiên cứu thử nghiệm kháng thể kháng virus Care trong phòng
và trị bệnh
4.3.2.1. Kết quả sử dụng kháng thể kháng virus Care trong phòng và trị bệnh ở quy mô phòng thí nghiệm
* Phòng bệnh
Chúng tôi sử dụng chủng virus Care cường độc CDV-HV để gây bệnh thực nghiệm cho chó từ đó thử nghiệm khả năng phòng và trị bệnh Care của chế phẩm kháng thể kháng virus Care vừa sản xuất. Thí nghiệm được chia thành 3 lô: (Lô 1: 10 con; Lô 2: 10 con; Lô 3: 10 con) để tiêm kháng thể kháng virus Care (ngày 0) với liều:
- Lô 1: 0,5 ml/2- 5 kg thể trọng. - Lô 2: 1 ml/ 2-5 kg thể trọng. - Lô 3: 1,5 ml/ 2-5kg thể trọng.
94
Ngày thứ 3 sau khi tiêm kháng thể kháng virus Care chúng tôi tiêm virus cường độc chủng CDV-HV cho 5 con ở mỗi lô; ngày thứ 7 chúng tôi tiêm virus cường độc ở 5 con còn lại. Kết quả ở Bảng 4.20.
Bảng 4.20. Kết quả thử nghiệm kháng thể kháng virus Care trong phòng bệnh Care
Lô thí nghiệm Liều tiêm
kháng thể
Số chó khỏe mạnh sau khi công cường độc Số chó
thí nghiệm
3 ngày sau khi tiêm
kháng thể
Số chó thí nghiệm
7ngày Sau khi tiêm
kháng thể
Lô 1 0,5 ml 5 5/5 5 3/5
Lô 2 1 ml 5 5/5 5 5/5
Lô 3 1,5 ml 5 5/5 5 5/5
Lô đối chứng Không tiêm 5 0/5 5 0/5
Kết quả cho thấy, với ở cả 3 liều tiêm kháng thể ở 3 lô thí nghiệm rồi công virus cường độc mỗi lô 5 con vào ngày thứ 3 sau khi tiêm kháng thể cả 5 chó thí nghiệm không ảnh hưởng gì, chó vẫn khỏe mạnh. Nhưng với ngày thứ 7 sau khi tiêm kháng thể thì những chó được tiêm với liều 0,5 ml bị chết (2/5) con, trong khi ở liều tiêm 1 ml và 1,5 ml chó vẫn sống khỏe mạnh (5/5). Như vậy, liều tiêm để phòng bệnh Care ở chó có thể sử dụng ở mức 1ml/liều cho 2-5 kg thể trọng (hiệu giá kháng thể là 9log2).
Sau khi thử khả năng phòng bệnh của kháng thể, chúng tôi tiến hành kiểm tra hiệu quả điều trị bệnh của kháng thể kháng virus Care ở cấp độ phòng thí nghiệm.
Chúng tôi tiêm virus cường độc CDV-HV vào 20 con chó (chia thành 4 lô). Lô 1: 5 con, điều trị theo phác đồ 1.
Lô 2: 5 con, điều trị theo phác đồ 2.
Lô 3: 5 con chỉ dùng phác đồ điều trị thông thường không dùng kháng thể. Lô 4: 5 con đối chứng âm, gây nhiễm nhưng không điều trị.
Chó mắc bệnh được đánh giá mức độ nhiễm bệnh theo từng giai đoạn dựa vào triệu chứng lâm sàng, các chỉ tiêu huyết học, tần số tim mạch và thời gian thử test chẩn đoán nhanh. Mức độ bệnh được chia như sau:
95
- Giai đoạn 1: sau gây nhiễm 1 ngày, các triệu chứng chưa rõ ràng, chó vẫn đi lại nhanh nhẹn, sốt 2 pha chỉ có biểu hiện viêm đường hô hấp nhẹ, nổi mụn mủ ở bụng các chỉ số huyết học chưa thay đổi nhiều. Thời gian thử test 20 phút cho kết quả vạch Control mờ.
- Giai đoạn 2: Sau gây nhiễm đã cho điều trị 5 ngày, các triệu chứng rõ ràng hơn, viêm mắt mũi kèm nhèm, có triệu chứng viêm phổi, đi ngoài ra máu, xuất huyết dưới da, các mụn mủ đã vỡ. Sừng hóa bàn chân, bong vẩy mũi. Các chỉ tiêu huyết học thay đổi. Bạch cầu tăng, hồng cầu giảm. Thận suy, men gan tăng, thời gian thử test 10 phút vạch control rõ.
- Giai đoạn 3: Sau gây nhiễm đã cho điều trị 15 ngày. Tất cả các triệu chứng điển hình, và có triệu chứng thần kinh. Các chỉ tiêu huyết học bạch cầu tăng cao hồng cầu giảm sâu, thận suy, men gan tăng.
Mỗi giai đoạn bệnh được chúng tôi thí nghiệm điều trị với liều kháng thể kháng virus Care là 0,5 ml và 1 ml/ 2- 5kg trọng lượng (tiêm bắp ngày 1-2 lần) ở cả lô 1 và lô 2. Kết quả thể hiện ở bảng 4.21.
Bảng 4.21. Kết quả thử nghiệm kháng thể trong điều trị bệnh Care
Giai đoạn bệnh Lô Số chó thí nghiệm Liều tiêm kháng thể Số ngày điều trị Số khỏi bệnh Số chết Tỷ lệ khỏi (%) 1 1 5 0,5 ml 5 5 0 100 2 3 4 5 5 5 1ml 0 0 5 5 0 5 4 0 0 1 5 100 80 0 2 1 5 0,5 ml 10 3 3 60 2 3 5 5 1ml 0 10 10 4 2 4 2 80 40 3 1 5 0,5 ml 15 0 0 0 2 3 5 5 1ml 0 15 15 1 0 1 0 10 0
96
Kết quả cho thấy ở giai đoạn bệnh đầu tiên khi điều trị với liều 0,5-1ml/ 5kg trọng lượng đều đạt 100%. Chó mắc bệnh ở giai đoạn 2 khi điều trị với liều 1 ml/5kg trọng lượng đạt hiệu quả 80% nhưng ở liều 0,5 ml hiệu quả điều trị chỉ đạt 60% (3/5 chó khỏi bệnh). Ở giai đoạn 3, cả hai liều điều trị 0,5 ml và 1 ml đều mang lại hiệu quả rất thấp, ở liều 0,5ml không có tác dụng. Liều 1ml đạt 10% nhưng thời gian điều trị kéo dài 2 tuần. Sau khi khỏi bệnh con vật còi cọc phát triển chậm. Ở lô đối chứng sau khi gây nhiễm không cho điều trị sau 5 ngày cả 5 con đều chết với đầy đủ các triệu chứng ở các giai đoạn của bệnh, có 1 con chết ở ngày thứ 2 sau gây nhiễm, 2 con chết ở ngày thứ 4 sau gây nhiễm và 2 con chết ở ngày thứ 5 sau gây nhiễm.
Từ đó cho thấy khi gây nhiễm bệnh Care cho chó và không điều trị thì 100% số chó đều chết theo từng giai đoạn của bệnh. Và mức độ và thời chết cũng phụ thuộc theo thể trạng và đề kháng của từng cá thể.
4.3.2.2. Nghiên cứu thử nghiệm kháng thể kháng virus Care trong điều trị bệnh Care trên chó mang đến khám và điều trị tại các phòng khám
Để đánh giá hiệu quả điều trị của chế phẩm kháng thể, chúng tôi chia 2 lô thí nghiệm.
Lô thứ nhất: Dùng liều kháng thể 0,5 ml/ 2-5kg thể trọng trong thời gian 5-7 ngày (Phác đồ 1).
Lô thứ hai: Dùng liều kháng thể 1ml-1,5 ml/ 2-5 Kg thể trọng trong thời gian 5-7 ngày (Phác đồ 2).
Kết quả điều trị lô thứ nhất được trình bày ở Bảng 4.22.
Kết quả điều trị ở lô thứ nhất cho thấy trong số 20 con được điều trị bằng kháng thể, số con được chữa khỏi là 14 con, số con chết là 6 con.
Như vậy hiệu quả điều trị ở liều kháng thể 0,5 ml/2-5 kg thể trọng ở giai đoạn 1 của bệnh có 5 con điều trị thì khỏi 5 con đạt tỷ lệ (100%). Ở giai đoạn 2 của bệnh có 11 con mắc bệnh điều trị khỏi 8 con đạt tỷ lệ (72,7%) chết (27,3%). Trong số chó bị chết ở giai đoạn 2 đều là chó ở lứa tuổi 2-4 tháng và là giống chó nhỏ có sức đề kháng kém. Kết quả phù hợp với nghiên cứu của tác giả (Larry J. Swango, 1984; Hines, 2006). Ở giai đoạn 3 của bệnh có 5 con mắc bệnh được điều trị ở liều 0,5ml kháng thể có 3 con chết chiếm 80% còn 20% khỏi bệnh.