2.3.4.1. Dựa vào đặc điểm dịch tễ học
Bệnh chủ yếu xảy ra ở chó từ 2-12 tháng tuổi, ở thời điểm giao mùa, thời tiết thay đổi, độ ẩm cao hoặc lạnh đột ngột.
2.3.4.2. Dựa vào triệu chứng lâm sàng
Chẩn đoán bệnh Care thể cấp tính và á cấp tính có thể dựa vào bệnh sử và triệu chứng lâm sàng. Khi có những triệu chứng sốt, triệu chứng ở đường hô hấp (viêm mũi, ho, viêm phổi, tiết dịch nhầy có mủ ở mắt và mũi), ỉa chảy, tăng sinh sừng hoá gan bàn chân, triệu chứng thần kinh thì có thể nghi chó mắc bệnh Care đặc biệt ở chó non chưa tiêm phòng.
Chẩn đoán lâm sàng trên chó có thể nhẫm lẫn với những bệnh sau: - Viêm gan truyền nhiễm: gan sưng to, đục giác mạc;
- Bệnh do Parvovirus gây viêm dạ dày, ruột xuất huyết (do hoại tử những tế bào thượng bì nhung mao ruột), chó non viêm cơ tim gây chết cao;
- Bệnh do Leptospira: viêm dạ dày, ruột chảy máu, viêm loét miệng và thường xuất huyết ở chó lớn, vàng da và niêm mạc, số lượng bạch cầu tăng;
- Với triệu chứng thần kinh: cần phân biệt với bệnh dại, bệnh do toxoplasma, các trường hợp ngộ độc hoặc bị ung thư. v.v.
2.3.4.3. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
•Tìm thể Lents
Lấy mẫu bệnh phẩm là dịch cạo niêm mạc mắt hay mũi chó bị bệnh, đem nhuộm Hematoxillin - Eosin, tìm tiểu thể Lents qua kính hiển vi. Cần chú ý ở não thể Lents rất giống thể Negri ở bệnh dại (David & Donald, 1979).
•Chẩn đoán virus học
Tiêm truyền bệnh phẩm cho động vật thí nghiệm
Mẫu bệnh phẩm là máu, lách, gan, phổi, các chất bài tiết và dịch nước mũi, nước mắt của chó nghi mắc bệnh đem nghiền, chế thành huyễn dịch và tiêm cho
24
động vật thí nghiệm. Tốt nhất là tiêm cho chồn hoặc chó con. Ngoài ra có thể tiêm cho chuột lang, chuột nhắt trắng, thỏ.
Quan sát tiến triển của bệnh gây ra trên động vật thí nghiệm, mổ khám bệnh tích đại thể và kết luận.
Trong bệnh phẩm có thể phân lập được một số vi khuẩn kế phát như
Pasteurella, Bacillus bronchisepticus, Staphylococcus, E. Coli và Salmonella.
Phân lập virus trên môi trường tế bào
Mẫu bệnh phẩm đem nghiền thành huyễn dịch, xử lý kháng sinh, ly tâm lấy nước trong và lọc qua màng lọc vi khuẩn rồi đem gây nhiễm lên môi trường tế bào một lớp thích hợp. Virus Care chỉ có thể nhân lên và gây bệnh tích tế bào (Cyto pathogenic Effect-CPE) khi gây nhiễm lên tế bào phù hợp. Bệnh tích tế bào do CDV gây ra có thể quan sát được là những thể hợp bào, tế bào bị phá hủy màng và xuất hiện thể vùi, ở trung tâm vùng tế bào xuất hiện CPE.
Sự xuất hiện nhiều hay ít, nhanh hay chậm của CPE phụ thuộc vào số lượng, độc lực của virus và “tuổi” tế bào. Tế bào mới nuôi cấy thì virus gây nhiễm dễ dàng hơn, CPE xuất hiện nhanh và nhiều hơn ở những tế bào đã nuôi cấy nhiều ngày (Lan & cs., 2005).
•Chẩn đoán huyết thanh học
Dùng phản ứng miễn dịch đánh dấu Enzym (ELISA).
Phương pháp kháng thể huỳnh quang trực tiếp phát hiện kháng thể nghi. •Chẩn đoán phát hiện ARN của virus Care bằng kỹ thuật RT-PCR
Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase ChainReaction)
là sự kết hợp giữa phương pháp phiên mã ngược và phương pháp PCR. Phương pháp này có thể phát hiện các ARN tồn tại với lượng rất thấp mà không thể phát hiện bằng các phương pháp khác.
Do Taq polymerase sử dụng trong PCR không hoạt động trên RNA nên trước hết cần chuyển RNA thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược Reverse Transcriptase (RT). Sau đó, cDNA này sẽ được khuếch đại nhờ Taq polymerase. Dấu hiệu xác định bệnh là sản phẩm nhân bản một đoạn gen đặc hiệu của virus. Sự hiện diện của sản phẩm này được nhận biết qua điện di trên gel agarose (Lan & cs., 2008).
25
•Chẩn đoán phát hiện bệnh Care bằng test chẩn đoán nhanh (kỹ thuật sắc ký miễn dịch)
Nguyên tắc: Phức hợp kháng kháng thể (KKT) gắn chất màu được phân bố đều trên vạch giấy sắc ký. Kháng nguyên đặc thù của vi sinh vật được gắn cố định tại “vạch phản ứng”. Khi nhỏ dung dịch cần xác định kháng thể lên bản sắc ký, KT đặc hiệu (nếu có) trong dung dịch sẽ kết hợp với KKT gắn màu, phức hợp miễn dịch KT-KKT gắn màu này di chuyển trên giấy sắc ký sẽ bị giữ lại tại” vạch phản ứng” do kháng thể kết hợp với KN vi sinh vật, kết quả “vạch phản ứng hiện màu”... Nếu trong dung dịch không có kháng thể đặc hiệu, ở “vạch phản ứng” KN không thể giữ được KKT gắn màu, vì vậy không hiện màu.
Nguyên lý: Kit thử chẩn đoán Care là dụng cụ sắc ký miễn dịch tính bằng dòng chảy một chiều để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên virus Care trong các dịch tiết của động vật mắc bệnh. Màng kit thử được phủ một lớp kháng thể kháng virus Care ở vùng kết quả. trong quá trình làm xét nghiệm, mẫu dung dịch từ dịch tiết của chó bệnh phản ứng với các phân tử mang theo kháng thể Care. Hỗn hợp tạo thành thấm theo màng di chuyển hướng lên nhờ các mao dẫn, gặp và phản ứng kết tủa màu với các kháng thể Care trên lớp màng và tạo ra vạch màu. Sự có mặt của vạch màu ở vừng kết quả trên Kit thử cho biết kết quả dương tính, ngược lại trong trường hợp không có vạch màu là kết quả âm tính. Nhằm mục đích kiểm tra quy trình thao tác xét nghiệm, một vạch màu luôn luôn xuất hiện tại vùng chứng (gọi là vạch chứng) để khẳng định rằng lượng mẫu đã đủ và lớp màng đã thấm tốt.
+ Kết quả:
- Dương tính: xuất hiện hai vạch đỏ rõ rệt: một ở vùng chứng gọi là vạch chứng (C), vạch kia là ở vùng kết quả gọi; là vạch kết quả (T).
Độ đậm màu đỏ của vạch kết quả (T) sẽ khác nhau phụ thuộc vào nồng độ của virus có trong mẫu phẩm. Vì vậy bất cứ độ mờ nào ở vạch kết quả (T) cũng đều được coi là dương tính.
- Âm tính: xuất hiện chỉ một vạch chứng (C) không thấy xuất hiện vạch kết quả (T).
26