2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2.5.Xác định những đột biến trên gen gyrA và đột biến kết hợp vớ
với bơm CmeABC
2.2.5.1. Khuếch đại trình tự vùng kháng quinolone của gen gyrA
và vùng trình tự nằm giữa cmeR và cmeABC
Cách tiến hành
Khuếch đại DNA đoạn trình tự mục tiêu trên gene gyrA và của bơm
CmeABC với các cặp mồi như trong bảng 2.6 bằng chu trình nhiệt như trong
bảng 2.7[100].
Bảng 2.6 Trình tự mồi khuếch đại vùng kháng quinolone của gen
gyrA và vùng trình tự nằm giữa cmeR-cmeABC
Gen mục
tiêu
Kích thước sản
phẩm Trình tự mồi Tham khảo
gyrA 250 bp 5’ GCTATGCAAAATGATGAGGC 3’
5’ TCAGTATAACGCATCGCAGC 3’ Wang, Y[100]
cmeR -
cmeABC 170 bp
5’ CTAAATGGAATCAATAGCTCC 3’
5’ GCACAACACCTAAAGCTAAAA 3’ Jun Lin [60]
Bảng 2.7 Chu trình nhiệt của phản ứng khuyếch đại vùng kháng
quinolone trên gen gyrA và bơm CmeABC
Bước Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
Biến tính 940C 2 phút 1 chu kỳ
Biến tính 940C 30 giây
Bắt cặp 600C 30 giây 35 chu kỳ
Kéo dài 720C 30 giây
Kéo dài 720C 5 phút 1 chu kỳ
Sau khi khuếch đại, tiến hành điện di sản phẩm khuếch đại để kiểm tra sự
hiện diện và kích thước của sản phẩm mong muốn theo nguyên tắc và cách tiến hành như trên.
Nguyên tắc
Sản phẩm DNA sau khi khuếch đại được tinh sạch để loại bỏ các thành phần như mồi, DNA polymerase, nucleotide và muối dư ra khỏi sản phẩm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong nghiên cứu này các sản phẩm khuếch đại được tinh chế bằng bộ
kít tinh chế sản phẩm phản ứng PCR của Qiagen (Hoa Kỳ). Bộ kít này tinh chế
sản phẩm PCR bằng việc sử dụng các cột gắn màng chứa hạt silica. Tinh sạch
gồm các bước: (1) hấp phụ sản phẩm PCR trên màng silica, (2) rửa màng để
loại bỏ các mồi, enzyme, muối,… (3) ly giải DNA vào dung dịch đệm PE.
DNA sau khi tinh sạch được đo nồng độ bằng máy đo quang phổ Nanodrop.
Cách tiến hành
Cho toàn bộ sản phẩm khuếch đại được trộn đều với 5 lần thể tích dung
dịch gắn DNA là BPI. Sau đó cho toàn bộ hỗn hợp vào cột QIAquick. Ly tâm
13500 vòng/1 phút để DNA bám vào cột và loại bỏ những thành phần không
cần thiết. Đổ bỏ dung dịch dưới cột, rửa cột với 0.75 ml dung dịch PE rồi ly
tâm 13500 vòng trong 1 phút. Đổ bỏ dung dịch dưới cột, ly tâm thêm một lần
nữa trong 1 phút. Đặt cột vào ống eppendorf sạch, dung giải DNA với nước cất
vô trùng, bảo quản ở
- 200C.
2.2.5.3. Giải mã trình tự nucleotide
Sử dụng phương pháp giải trình tự bằng máy tự động, dựa trên nguyên tắc enzyme học thông qua việc sử dụng các dideoxynucleotid được Sanger mô
tả năm 1972. Hệ thống giải mã trình tự tự động được sử dụng là hệ thống
Hình 2.3 Nguyên tắc đọc trình tự bằng máy
Hình 2.4 Máy giải trình tự tự động 3130XL (Applied Biosystem)
a) Khuếch đại trình tự đích
Nguyên tắc
Nguyên tắc của phản ứng khuếch đại để giải trình tự giống với phản ứng
PCR bình thường, DNA polymerase cùng với sự hiện diện của mồi sẽ tổng hợp đoạn DNA cần xác định với sự hiện diện của hai loại dNTP và dideoxynucleotide - ddNTP có gắn màu huỳnh quang trong phản ứng. Bốn loại ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP được đánh dấu bằng 4 màu huỳnh quang khác
Cách tiến hành
Sử dụng sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch làm vật liệu cho phản ứng PCR giải trình tự theo bộ kít BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequence Kit (Applied Biosystem) với các thành phần và chương trình theo bảng 2.8 và 2.9.
Bảng 2.8 Thành phần phản ứng PCRgiải trình tự
DNA mục tiêu 35 - 45 ng
Mồi xuôi hoặc mồi ngược 0,5 µl
BigDye Terminator 1 µl Dung dịch đệm 2 µl Nước cất Vừa đủ 10 µl Bảng 2.9 Chương trình phản ứng PCR giải trình tự 960C 1 phút 1 chu kỳ 960C 10 giây 25 chu kỳ 500C 5 giây 600C 4 phút (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Vùng kháng quinolone-QRDR của gen gyrA và vùng gắn cmeR thuộc
promoter của bơm CmeABC được giải trình tự với cùng cặp mồi dùng để
khuếch đại (bảng 2.6).
b) Tinh sạch và tủa sản phẩm khuếch đại
Nguyên tắc
Dùng Ethanol 95% để tranh giành các liên kết giữa nước và các phân tử
DNA làm cho DNA mất nước và tủa. Thu DNA ở dạng tủa, rửa và hòa tan trong dung dịch HIDI formamide (Applied Biosystem).
Cách tiến hành
Sản phẩm của phản ứng PCR giải trình tự được tủa với ethanol, EDTA
và natri oxalate theo các bước sau:
- Cho vào mỗi ống eppendorf 2 µl dung dịch dừng phản ứng (gồm các thành phần NaOAc 1,5 M và EDTA 50 mM).
- Chuyển hết sản phẩm PCR giải trình tự vào ống eppendorf có chứa sẵn
dung dịch dừng phản ứng và trộn kỹ.
- Thêm 35 µl ethanol 95% lạnh vào và trộn kỹ. Ngay lập tức đem ly tâm với
tốc độ 13.200 vòng/phút trong 15 phút ở 4o
C. Loại bỏ ethanol.
- Rửa tủa 2 lần, mỗi lần với 200 µl ethanol 70% lạnh. Ly tâm với tốc độ
13.200 vòng/phút trong 15 phút ở 4o
C, loại bỏ ethanol. - Làm khô trong máy hút chân không trong 15 phút.
Hòa tan mẫu tủa trong 10 µl dung dịch nạp mẫu HiDi formamide
(Applied Biosystem). Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút để DNA tan hoàn toàn. Trình tự DNA đượcxác định bằng máy giải trình tự (Applied Biosystem).
c) Phân tích kết quả giải trình tự
Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm Sequencing analysis tương ứng. Đột biến ở vùng kháng quinolones trên gen gyrA được phân tích
bằng phần mềm Vector NTI Suit 7 và so sánh với trình tự tham khảo là gen
gyrA của C. jejuni với mã số đăng nhập trên NCBI là L04566 [100]. Tương tự, phân tích đoạn trình tự (5’-TGTAATAAATATTACA-3’) thuộc promoter của bơm CmeABC bằng cách so sánh vùng trình tự này giữa 40 chủng nghiên cứu
với trình tự tham khảo là trình tự gen cmeR của C. jejuni 81-176 với mã số đăng nhập trên NCBI là AF466820 [60] để tìm kiếm những đột biến.
Thống kê và so sánh kết quả giải trình tự với các dữ liệu vi sinh (phụ lục
1.4 và 1.5). Các số liệu được xử lý bằng thuật toán Kruskal Wallis, với độ tin
cậy 95% bằng phần mềm thống kê Stata 9.
Sơ đồ 2.3 Quy trình thực hiện phương pháp MLST (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
a) Khuếch đại và giải trình tự các phân đoạn gen bên trong 7 gen giữ nhà
DNA bộ gen
Khuếch đại các phân đoạn khoảng
450 bp bên trong các gen giữ nhà
Giải trình tự 7 phân đoạn gen trên cả hai
mạch
So sánh trình tự của mỗi phân đoạn gen với
trình tự allele đã biết tại mỗi locus
Nhận được các số của allele tại 7 loci để tạo
nên dữ liệu về allele
So sánh dữ liệu các allele với dữ liệu của các
mẫu phân lập thuộc bảng dữ liệu trung tâm
thông qua internet và nhận về kết quả kiểu
Sử dụng bảy cặp mồi oligonucleotide được lấy từ trang web pubMLST
[110] để khuếch đại 7 phân đoạn gen giữ nhà của 40 chủng C. jejuni, C. coli
với hệ thống mồi và chu trình nhiệt như trong bảng 2.10 và 2.11.
Bảng 2.10 Hệ thống mồi MLST cho C. jejuni và C. coli [23]
Gen Trình tự mồi
aspA Mồi xuôi: A9 AGTACTAATGATGCTTATCC
Mồi ngược: A10 ATTTCATCAATTTGTTCTTTGC
glnA Mồi xuôi: A1 TAGGAACTTGGCATCATATTACC
Mồi ngược: A2 TTGGACGAGCTTCTACTGGC
gltA Mồi xuôi: A1 GGGCTTGACTTCTACAGCTACTTG
Mồi ngược : A2 CCAAATAAAGTTGTCTTGGACGG
glyA Mồi xuôi: A1 GAGTTAGAGCGTCAATGTGAAGG
Mồi ngược: A2 AAACCTCTGGCAGTAAGGGC
pgm Mồi xuôi: A7 TACTAATAATATCTTAGTAGG
Mồi ngược: A8 CACAACATTTTTCATTTCTTTTTC
tkt Mồi xuôi: A3 GCAAACTCAGGACACCCAGG
Mồi ngược: A6 AAAGCATTGTTAATGGCTGC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
uncA Mồi xuôi: A7 ATGGACTTAAGAATATTATGGC
Mồi ngược: A2 GCTAAGCGGAGAATAAGGTGG
Bảng 2.11 Chương trình của phản ứng PCR của MLST
Bước Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
Biến tính 950C 3 phút 1 chu kỳ
Biến tính 940C 2 phút
Bắt cặp 500C 1 phút 35 chu kỳ
Kéo dài 720C 1 phút
Sản phẩm sau khi khuếch đại đem đi điện di để kiểm tra xem có sản
phẩm hay không và sản phẩm có đúng kích thước hay không. Sau khi xác định
là có sản phẩm khuếch đại của 7 gen mục tiêu, tinh sạch sản phẩm khuếch đại theo các bước tiến hành của quy trình tinh sạch sản phẩm PCR.
Tiếp theo, tiến hành khuếch đại để giải trình tự các phân đoạn khảng từ
400 – 500 bp của các sản phẩm khuếch đại của 7 gen với hệ thống mồi như
trong bảng 2.12 và theo thành phần, chương trình giải trình tự như trong bảng
2.8 và 2.9.
Bảng 2.12 Hệ thống mồi giải trình tự MLST cho C. jejuni và C. coli [23]
Gen Trình tự mồi
aspA Mồi xuôi: S3 CCAACTGCAAGATGCTGTACC
Mồi ngược: S6 TTAATTTGCGGTAATACCATC
glnA Mồi xuôi: S3 CATGCAATCAATGAAGAAAC
Mồi ngược: S6 TTCCATAAGCTCATATGAAC
gltA Mồi xuôi: S1 GTGGCTATCCTATAGAGTGGC
Mồi ngược: S6 CCAAAGCGCACCAATACCTG
glyA Mồi xuôi: S3 AGCTAATCAAGGTGTTTATGCGG
Mồi ngược: S4 AGGTGATTATCCGTTCCATCGC
pgm Mồi xuôi: S5 TACTAATAATATCTTAGTAGG
Mồi ngược: S2 TCCAGAATAGCGAAATAAGG
tkt Mồi xuôi: S5 GCTTAGCAGATATTTTAAGTG
Mồi ngược: S4 ACTTCTTCACCCAAAGGTGCG
uncA Mồi xuôi: S5 TGT TGCAATTGGTCAAAAGC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mồi ngược: S4 TGCCTCATCTAAATCACTAGC
b) Cách thu được dữ liệu về các allele
Sau khi giải trình tự các phân đoạn gen bên trong 7 gen giữ nhà, sử dụng chương trình AlignX để so sánh trình tự của mỗi phân đoạn gen của các allele với các allele đã biết (trình tự allele được tải từ trang web pubMLST [111] tại
mỗi locus). Sau đó nhập trình tự của mỗi allele hay của cả 7 allele của mỗi mẫu
(http://pubmlst.org/Campylobacter/). Kết quả nhận về là dữ liệu về số của 7 allele tại 7 loci của mỗi mẫu phân lập.
Hình 2.5 Cách thu nhận số của allele aspA9
Sau khi có dữ liệu về các allele, tiếp tục nhập dữ liệu này lên mục tìm ST của trang web MLST để thu được số của kiểu trình tự - sequence type và phức hợp dòng – clonal complex của mỗi mẫu phân lập.
Vị trí nhập trình tự Số allele thu được Số ST thu được Dữ liệu 7 allele của một mẫu phân lập Kiểu clonal
Hình 2.6 Cách thu được số ST, CC của một mẫu phân lập
c) Phân tích kết quả giải trình tự MLST
Sử dụng phần mềm START để phân tích dữ liệu MLST và Bionumeric
để vẽ cây Minimum Spanning Tree.
· START
Chương trình START (Sequence Type Analysis and Recombinational Tests)được thiết kế bởi Jolley và đồng sự, sử dụng thuật toán BURST để phân
tích dữ liệu MLST [48]. Chương trình START phân tích dữ liệu về trình tự để
tìm mối quan hệ về phát sinh loài giữa các ST, tính tần số của các allele, số lượng allele tại mỗi locus, số lượng các vị trí thay đổi, tỉ số giữa đột biến khác
nghĩa / đột biến đồng nghĩa (dN/dS).
· Minimum Spanning Tree
Minimum spanning tree (MST) là một cách tiếp cận mới được sử dụng để cho thấy mối quan hệ giữa các mẫu phân lập. Cây MST liên kết hết tất cả
các mẫu trong bảng dữ liệu đưa vào theo phương cách là khoảng cách tổng
cộng của tất cả các nhánh là nhỏ nhất. Quy luật vẽ cây MST theo phần mềm
Bionumeric là mỗi vòng tròn tượng trưng cho một kiểu trình tự ST và kích
thước vòng tròn đại diện cho số lượng các chủng có chung kiểu ST đó.Vòng sáng có màu bao quanh các vòng tròn là cách phân nhóm của phần mềm
Bionumeric. Các ST chung một vòng sáng là chung một nhóm, mỗi một nhóm