Phân lập và định danh Campylobacter

Một phần của tài liệu Tìm hiểu một số đặc điểm của vi khuẩn campylobacter gây bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột ở trẻ em dưới 5 tuổi ở thành phố hồ chí minh từ năm 2009 đến năm 2010 (Trang 43 - 47)

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.2.1. Phân lập và định danh Campylobacter

Mẫu phân

Phân lập và định danh

Làm kháng sinh đồ và xác định MIC đối với

một số kháng sinh

Phân biệt C. jejuniC. coli bằng PCR

Nghiên cứu cơ chế kháng

fluoroquinolone

Khuếch đại và giải trình tự

trình tự vùng kháng quinolone của gen gyrA và vùng trình tự nằm giữa cmeR

và bơm cmeABC

Khuếch đại và giải trình tự các phân đoạn gen

bên trong 7 gen giữ nhà Phân loại Campylobacter

Sơ đồ 2.2 Các bước định danh C. jejuni và C. coli [2] Mẫu bệnh phẩm

(mẫu phân)

Cấy trên môi trường

mCCDA

Ủ vi hiếu khí ở nhiệt độ 42 oC

Chọn khuẩn lạc đặc trưng

Nhuộm Gram và xem hình thể dưới kính hiển vi

Thử phản ứng phân giải

Campylobacter spp. Chọn khuẩn lạc bắt màu Gram âm và có hình dấu

ngã, cánh chim

Thử Oxidase và Catalase

Bước 1: Chuẩn bị mẫu và cấy sang môi trường thạch chọn lọc

mCCDA

Mẫu phân được lấy trực tiếp từ bệnh nhân, giữ trong lọ vô trùng. Dùng que cấy cấy mẫu bệnh phẩm lên môi trường chọn lọc cho Campylobacter là mCCDA. Ủ vi hiếu khí với túi CampyGenở 42 o

C trong thời gian 48h.

Bước 2: Xác định hình thể vi khuẩn

Qua ngày thứ 3, chọn những khuẩn lạc nhỏ, dẹt, bóng, thường mọc lan,

màu trắng xám để tiến hành nhuộm gram và quan sát hình dạng dưới kính hiển vi . Đây là một bước rất quan trọng trong việc xác định Campylobacter vì vi khuẩn này có hình dạng đặc trưng.

Campylobacter là vi khuẩn Gram âm nên bắt màu đỏ, có hình dấu ngã hay hình cánh chim. Trường hợp vi khuẩn nuôi cấy quá 48 giờ và có sự tiếp

xúc với oxy không khí thì Campylobacter chuyển sang dạng hình cầu.

Bước 3: Cấy chuyển sang môi trường thạch máu

Từ khuẩn lạc đã xác định được hình thể trên thạch đĩa CCDA, dùng que cấy ria sang môi trường thạch máu BA.Nuôi cấy trong điều kiện vi hiếu khí ở

420C/24h để tiến hành kiểm tra sinh hóa.

Bước 4: Kiểm tra các phản ứng sinh hóa

Phản ứng Catalase

Nhỏ một giọt H2O2 3% vào lam kính, dùng que cấy lấy khuẩn lạc thuần đặt vào giữa giọt H2O2 . Nếu thấy sủi bọt là phản ứng dương tính.

Dùng một tăm bông phết một ít khuẩn lạc thuần, sau đó nhỏ vài giọt

thuốc thử Oxidase lên, đọc kết quả trong 10 giây đầu. Phản ứng dương tính khi

thấy xuất hiện màu tím xanh tại chỗ phết khuẩn lạc. Phản ứng phân giải Natri Hippurate

Đây là phản ứng cần thiết để phân biệt được đó là Campylobacter jejuni

hay Campylobacter coli.

Cách tiến hành

Cho khuẩn lạc vi khuẩn Campylobacter vào trong ống eppendorf 1.5 ml

có chứa sẵn 1 ml dung dịch natri hippurate 1% rồi trộn đều. Ủ 2-3 giờ, cho

thuốc thử Ninhydrin vào. Sau 1 giờ đọc kết quả:

· Nếu dung dịch chuyển thành màu xanh thì đó là Campylobacter jejuni

(phản ứng phân giải hippurate dương tính).

· Nếu dung dịch không đổi màu thì đó là Campylobacter coli (phản ứng

phân giải hippurate âm tính) Cơ chế của phản ứng

Campylobacter jejuni có gen hipO mã hóa cho enzyme hippuricase sẽ

phân giải natri hippurare thành acid benzoic và glycine. Khi cho thuốc thử

ninhydrin vào hỗn hợp thì ninhydrin sẽ phản ứng với glycine tạo thành phức

hợp màu xanh dương. Trong khi Campylobacter coli không có enzyme hippuricase không tạo phản ứng đổi màu.

Tiêu chuẩn xác định là Campylobacter spp.

- Campylobacter là vi khuẩn Gram âm, có thể có hình lượn sóng hay

hình cánh chim, phát triển được trên môi trường chọn lọc cho

Campylobacterở nhiệt độ 42 o

C ở điều kiện vi hiếu khí

- Catalase (+)

Một phần của tài liệu Tìm hiểu một số đặc điểm của vi khuẩn campylobacter gây bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột ở trẻ em dưới 5 tuổi ở thành phố hồ chí minh từ năm 2009 đến năm 2010 (Trang 43 - 47)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(128 trang)