2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2.1. Phân lập và định danh Campylobacter
Mẫu phân
Phân lập và định danh
Làm kháng sinh đồ và xác định MIC đối với
một số kháng sinh
Phân biệt C. jejuni và C. coli bằng PCR
Nghiên cứu cơ chế kháng
fluoroquinolone
Khuếch đại và giải trình tự
trình tự vùng kháng quinolone của gen gyrA và vùng trình tự nằm giữa cmeR
và bơm cmeABC
Khuếch đại và giải trình tự các phân đoạn gen
bên trong 7 gen giữ nhà Phân loại Campylobacter
Sơ đồ 2.2 Các bước định danh C. jejuni và C. coli [2] Mẫu bệnh phẩm
(mẫu phân)
Cấy trên môi trường
mCCDA
Ủ vi hiếu khí ở nhiệt độ 42 oC
Chọn khuẩn lạc đặc trưng
Nhuộm Gram và xem hình thể dưới kính hiển vi
Thử phản ứng phân giải
Campylobacter spp. Chọn khuẩn lạc bắt màu Gram âm và có hình dấu
ngã, cánh chim
Thử Oxidase và Catalase
Bước 1: Chuẩn bị mẫu và cấy sang môi trường thạch chọn lọc
mCCDA
Mẫu phân được lấy trực tiếp từ bệnh nhân, giữ trong lọ vô trùng. Dùng que cấy cấy mẫu bệnh phẩm lên môi trường chọn lọc cho Campylobacter là mCCDA. Ủ vi hiếu khí với túi CampyGenở 42 o
C trong thời gian 48h.
Bước 2: Xác định hình thể vi khuẩn
Qua ngày thứ 3, chọn những khuẩn lạc nhỏ, dẹt, bóng, thường mọc lan,
màu trắng xám để tiến hành nhuộm gram và quan sát hình dạng dưới kính hiển vi . Đây là một bước rất quan trọng trong việc xác định Campylobacter vì vi khuẩn này có hình dạng đặc trưng.
Campylobacter là vi khuẩn Gram âm nên bắt màu đỏ, có hình dấu ngã hay hình cánh chim. Trường hợp vi khuẩn nuôi cấy quá 48 giờ và có sự tiếp
xúc với oxy không khí thì Campylobacter chuyển sang dạng hình cầu.
Bước 3: Cấy chuyển sang môi trường thạch máu
Từ khuẩn lạc đã xác định được hình thể trên thạch đĩa CCDA, dùng que cấy ria sang môi trường thạch máu BA.Nuôi cấy trong điều kiện vi hiếu khí ở
420C/24h để tiến hành kiểm tra sinh hóa.
Bước 4: Kiểm tra các phản ứng sinh hóa
Phản ứng Catalase
Nhỏ một giọt H2O2 3% vào lam kính, dùng que cấy lấy khuẩn lạc thuần đặt vào giữa giọt H2O2 . Nếu thấy sủi bọt là phản ứng dương tính.
Dùng một tăm bông phết một ít khuẩn lạc thuần, sau đó nhỏ vài giọt
thuốc thử Oxidase lên, đọc kết quả trong 10 giây đầu. Phản ứng dương tính khi
thấy xuất hiện màu tím xanh tại chỗ phết khuẩn lạc. Phản ứng phân giải Natri Hippurate
Đây là phản ứng cần thiết để phân biệt được đó là Campylobacter jejuni
hay Campylobacter coli.
Cách tiến hành
Cho khuẩn lạc vi khuẩn Campylobacter vào trong ống eppendorf 1.5 ml
có chứa sẵn 1 ml dung dịch natri hippurate 1% rồi trộn đều. Ủ 2-3 giờ, cho
thuốc thử Ninhydrin vào. Sau 1 giờ đọc kết quả:
· Nếu dung dịch chuyển thành màu xanh thì đó là Campylobacter jejuni
(phản ứng phân giải hippurate dương tính).
· Nếu dung dịch không đổi màu thì đó là Campylobacter coli (phản ứng
phân giải hippurate âm tính) Cơ chế của phản ứng
Campylobacter jejuni có gen hipO mã hóa cho enzyme hippuricase sẽ
phân giải natri hippurare thành acid benzoic và glycine. Khi cho thuốc thử
ninhydrin vào hỗn hợp thì ninhydrin sẽ phản ứng với glycine tạo thành phức
hợp màu xanh dương. Trong khi Campylobacter coli không có enzyme hippuricase không tạo phản ứng đổi màu.
Tiêu chuẩn xác định là Campylobacter spp.
- Campylobacter là vi khuẩn Gram âm, có thể có hình lượn sóng hay
hình cánh chim, phát triển được trên môi trường chọn lọc cho
Campylobacterở nhiệt độ 42 o
C ở điều kiện vi hiếu khí
- Catalase (+)