1. TỔNG QUAN
1.10 Các phương pháp phân loại Campylobacter
Có rất nhiều phương pháp phân loại được phát triển để xác định và phân biệt các chủng Campylobacter dựa vào kiểu hình - phenotyping hay dựa vào kiểu gen - genotyping.
Các phương pháp dựa vào kiểu hình thì dựa vào các đặc tính sinh hóa
hay việc tiết protein của vi khuẩn. Đối với C. coli và C. jejuni thì phương pháp
kiểm tra kiểu hình quan trọng nhất là serotyping gồm phương pháp dựa vào kháng nguyên bền nhiệt của Penner và phương pháp khác dựa vào kháng nguyên không bền nhiệt của Lior. Ưu điểm của phương pháp dựa vào kiểu hình là có khả năng sàng lọc một số lượng lớn các mẫu phân lập với giá thành rẻ, nhưng nhược điểm là khả năng phân biệt không cao.
Vì các phương pháp phân loại dựa vào kiểu hình chưa đủ sức mạnh để
phân biệt giữa các chủng nên ngày càng có nhiều phương pháp dựa vào kiểu gen để phân loại Campylobacter. Các phương pháp này có hiệu quả phân biệt
tốt giữa các chủng và có thể được sử dụng cho những nghiên cứu dịch tễ.
Một phương pháp dựa vào kiểu gen - genotyping được sử dụng phổ biến để phân loại Campylobacter là điện di trường xung (Pulsed field gel electrophoresis -PFGE). Nguyên tắc của phương pháp này là phân cắt toàn bộ
DNA nhiễm sắc thể của tế bào với các enzyme cắt giới hạn hiếm tạo ra tương đối ít các phân đoạn DNA có kích thước khá lớn. Các phân đoạn DNA này sau
đó được tách biệt nhau theo kích thước bởi một phương pháp điện di đặc biệt đó là điện di trong trường xung. Nguyên tắc của điện di trong trường xung là dựa vào sự thay đổi hướng điện trường trong quá trình điện di. Mỗi lần hướng điện trường thay đổi thì phân tử DNA phải tự định hướng lại. Thời gian cần
cho việc tự định hướng lại tùy thuộc vào kích thước của phân tử, phân tử càng dài thì thời gian tự định hướng lại càng lớn khiến nó di chuyển chậm hơn. Những thay đổi của các vị trí cắt giới hạn sẽ tạo nên một dữ liệu về các kiểu
vạch DNA khác nhau của mỗi vi khuẩn. Dựa vào dữ liệu này ta có thể so sánh được hai mẫu phân lập bất kỳ có phải là cùng một chủng vi khuẩn hay không.
Nếu dữ liệu về các kiểu vạch DNA của hai mẫu này giống nhau thì chúng được
xem là cùng một chủng vi khuẩnvà ngược lại.
Hai kỹ thuật genotyping khác cũng hay sử dụng là phương pháp phân tích độ đa hình của các phân đoạn được khuếch đại (Amplified fragment length polymorphism - AFLP) và phương pháp Fla - typing.
Nguyên tắc của phương pháp AFLP là phân cắt DNA nhiễm sắc thể với
hai enzyme cắt giới hạn khác nhau gồm một enzyme cắt hiếm và một enzyme
cắt thường xuyên. Sau đó các sản phẩm cắt ra được nối với “adaptor” có thiết
kế đặc biệt gồm một trình tự lõi DNA đã biết và một trình tự chuyên biệt cho
enzyme cắt giới hạn. Trình tự adaptor này sau đó được sử dụng làm trình tự
mồi khuếch đại. Một trong hai mồi sử dụng được đánh dấu phóng xạ hay huỳnh quang để có thể quan sát được sự di chuyển của DNA. Để giới hạn mức độ đa
hình của vị trí cắt giới hạn, các mồi được thêm vào một hay nhiều nucleotide
chuyên biệt gần bên vị trí cắt giới hạn. Lúc đó chỉ có những phân đoạn nào chứa các nucleotide chuyên biệt gần bên vị trí cắt giới hạn mới được phát hiện
và phân tích. Các sản phẩm PCR sau đó được biến tính và chạy trên gel acrylamide của máy giải trình tự hay phân tích trên gel polyacrylamide biến
tính. So sánh dữ liệu các vạch trên gel hay dựa vào kết quả điện di đồ của máy
Phương pháp Fla - typing (fla – PCR RFLP) liên quan đến việc khuếch đại các gen flagellin bởi PCR và sau đó phân cắt các sản phẩm PCR với
enzyme cắt giới hạn. Gen mã hóa cho flagellin có chứa cả những vùng bảo tồn
và những vùng thay đổi cho nên nó rất thích hợp đối với phương pháp phân tích độ đa hình của những phân đoạn cắt giới hạn của một sản phẩm PCR
(Restriction fragment length polymorphism-RFLP). Các phân đoạn được cắt ra
sẽ tách ra nhau theo kích thước khi điện di trên gel agarose. Các chủng giống
nhau sẽ có dữ liệu các vạch DNA trên gel giống nhau và ngược lại.
Ngoài ra còn nhiều phương pháp xác định kiểu gen khác được sử dụng để phân loại Campylobacter như: Random Amplyfied polymorphic DNA (RAPD), ribotyping.
Bảng 1.4 Ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp phân loại
dựa vào kiểu gen Campylobacter [103]
Phương pháp Sức mạnh phân biệt Khả năng phân loại (%) Tính lặp lại (%) Sự nhạy với sự bất ổn định di truyền Thời gian thực hiện Chi phí
Serotyping Trung bình 80 Tốt <1 ngày Thấp
RAPD Trung bình 80 Thấp Có < 1 ngày Thấp
Ribotyping Trung bình 100 Tốt Có 3-4 ngày Trung
bình
AFLP Tốt 100 Tốt Không 2-3 ngày Trung
bình
Fla typing Vừa phải 100 Tốt Có < 1 ngày Thấp
PFGE Tốt 100 Tốt Có 3-4 ngày Trung
bình
bình
Chú thích:
· Sức mạnh phân biệt của một phương pháp là khả năng phân biệt giữa
các chủng không liên quan về di truyền
· Khả năng phân loại là 100% nếu tất cả các chủng kiểm tra đều có thể được phân loại bởi một phương pháp
· Tính lặp lại của một phương pháp được xác định bởi khả năng của phương pháp đó xác định nhiều mẫu lặp lại với cùng một kết quả
· Sự bất ổn định di truyền là sự thay đổi đáng kể kiểu gen của các thế hệ
con trong cùng một dòng (clone)