CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp phân lập và lưu trữ các chủng vi sinh vật
Pha loãng mẫu và cấy trên môi trường đĩa thạch:
Bước 1: Cân 10 g mẫu (phân compost, rác thải, đất…) cho vào cối sứ nghiền nhỏ, sau đó cho vào bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lý đã được khử trùng.
Bước 2: Lắc trên máy lắc trong thời gian 30 phút, sau đó để lắng. Ta có dung dịch mẫu pha loãng 10-1 lần.
Bước 3: Dùng pipetman hút 1ml dịch huyền phù ở độ pha loãng10-1 đưa vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng. Trộn đều ta có dịch pha loãng 10-2 lần.
Bước 4: Dùng pipetman hút 0,1 ml (100 µl) dịch huyền phù ở độ pha loãng10-2 đưa vào ống epppendorf chứa 0,9 ml nước cất vô trùng. Trộn đều ta có dịch pha loãng 10-3 lần.
Tiếp tục làm như trên, ta có một loạt độ pha loãng dịch mẫu khác nhau như ý.
Bước 5: Lấy 0,1 ml dịch ở các nồng độ từ 10-4 đến 10-6 nhỏ và dàn đều trên đĩa petri chứa môi trường GauzeI và Hans. Để trong tủ ấm ở nhiệt độ 28oC, 37oC hoặc cao hơn (nếu muốn phân lập VSV chịu nhiệt) trong 24h-48h sao cho có thể thấy rõ các khuẩn lạc riêng biệt.
Bước 6: Các khuẩn lạc có hình dạng, màu sắc khác nhau được tách riêng, làm thuần và giữ trong ống nghiệm để sử dụng cho các thí nghiệm sau.
Các môi trường nuôi cấy trong nghiên cứu:
Môi trường NA: Meat extract 1g; Yeast extract 5g; pepton 5g; NaCl 5g.
Môi trường Ashby: Glucoze 20g ; K2HPO4 0,2g ; MgSO4.7H2O 0,2g ;NaCl 0,2g ; K2SO4 0,1g ; CaCO3 5g; Thạch 20g ; Nước cất 1000ml ; pH 7 - 7,2.
Môi trường King B: Yeast extract 5g; pepton 20g; glyxerin 5 ml; K2HPO4 (12,5%) 12 ml; MgS04.7H20 (6,25%) 25 ml; nước cất 1000 ml. pH 7.
Môi trường Pikovskaia: Glucoza 10g; yeast extract 0,5g; K2HPO4 o,5g; MgSO4 0,3g; Ca3(PO4)2 5g; dung dịch vi lượng 2ml; nước cất 1000ml. pH 7.
Môi trường AT: CaCO320g; Glucoza 20g; K2HPO40,8g; MgSO-4.7H2O 0,5g; KH2PO4 0,2g; FeCl3.6H2O 0,1g; Na2MoO4.2H2O 0,05g; nước
cất 1000ml. pH 7.
Môi trường Hans: K2HPO4: 0,5g; KH2PO4: 0,5g; (NH4)2SO4: 1g; MgSO4.7H2O: 0,1g; CaCl2: 0,1g; NaCl: 6g; Cao nấm men: 0,1g; CMC: 0,1g; Thạch: 12g; H2O: 1.000ml; pH=7.
Môi trường Gauze I: để phân lập và nhân sinh khối xạ khuẩn phân giải xenlulo K2HPO4: 0,5g; KH2PO4: 0,5g; MgSO4.7H2O: 0,5g; NaCl: 0,5g; KNO3: 1g; FeSO4.7H2O: 0,01g; Tinh bột tan: 20g; thạch: 12g; H2O: 1000ml; pH=7.
Môi trường gluco peptone agar (GPA): 1000ml; NaCl: 5g; Pepton: 10g; pH= 7,5.
Môi trường PDA: Glucoza: 20.0 g; Khoai tây: 200.0 g; Thạch: 15 g nước cất 1000 ml; pH=7.
Môi trường CMC đặc: CMC: 1g; Thạch: 12g; H2O: 1.000ml. Dung dịch nước muối sinh lý: NaCl: 0,85g; nước cất: 100ml
2.3.2. Phương pháp xác định định tính hoạt tính CMC- aza (Williams, 1983).
Sinh khối các chủng vi sinh vật sau khi nuôi cấy 48h được li tâm lắng gạn bỏ phần cặn lắng và nhỏ 1ml vào các lỗ thạch đã được chuẩn bị sẵn trên các đĩa Petri chứa môi trường CMC đặc (CMC: 1g; Thạch: 12g; H2O: 1.000 ml). Lưu giữ đĩa thạch trong tủ ấm 24 h, sau đó lấy ra và tráng bề mặt thạch bằng dung dịch lugol.
Hoạt tính sinh học được xác định bằng kích thước vòng phân giải, vòng tròn trong suốt bao quanh lỗ thạch ((hiệu số giữa đường kính vòng tròn trong suốt (D) và đường kính lỗ thạch (d).