CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.4. Phương pháp tuyển chọn vi sinh vật phân giải phốtpho
Lấy 10 g mẫu cho vào cối sứ nghiền nhỏ và đưa vào bình tam giác có chứa 90 ml nước cất vô trùng (độ pha loãng 10-1) lắc bằng máy lắc ở tốc độ 100 vòng/phút trong 15 phút. Hút 0,5 ml dịch cho vào ống nghiệm có chứa 4,5 ml nước cất vô trùng ta được nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục làm như vậy cho tới khi thu được độ pha loãng thích hợp. Lấy pipet vô trùng hút 0,1 ml dịch huyền phù từ các ống nghiệm có độ pha loãng thích hợp cho vào đĩa Petri có chứa môi trường Pikowskia. Gạt đều và ủ ở 30oC trong vài ngày cho tới khi xuất hiện khuẩn lạc. Với mỗi độ pha loãng cấy ra 3 đĩa. Sau khi xuất hiện khuẩn lạc trên các đĩa, đếm số khuẩn lạc vi sinh vật có vòng bao quanh. Đây chính là các vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất phốt pho vô cơ khó tan. Đồng thời đếm tổng số VSV có trên các môi trường tổng số để tính tần số bắt gặp vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất phốt pho vô cơ khó tan. Các khuẩn lạc này chưa đảm bảo thuần khiết về mặt di truyền và giữ mức độ ổn định hoạt tính cho nên cần phải giữ chúng trong các ống nghiệm giữ giống để làm sạch.Để làm sạch dùng que cấy vô trùng lấy một vòng que cấy sinh khối của giống cần làm sạch cho vào ống nghiệm chưa 4,5 ml nước cất vô trùng. Trộn đều và pha loãng tiếp cho đến khi đạt được độ pha loãng thích hợp. Hút 0,1 ml dịch huyền phù từ các độ pha loãng thích hợp nhỏ vào đĩa pettri có chứa môi trường Pikowskia gạt đều và ủ cho đến khi xuất hiện khuẩn lạc. Giữ các khuẩn lạc riêng rẽ có vòng trong bao quanh trong ống nghiệm giữ giống và tiếp tục làm sạch cho đến khi thu được giống thuần khiết. Cấy truyền những khuẩn lạc có vòng phân hủy sang ống nghiệm thạch nghiêng để giữ giống.
Đánh giá hoạt tính phân giải phốt phát của vi sinh vật (theo TCVN 8565:2010), Lựa chọn sơ bộ dựa trên độ lớn và độ trong của vòng phân hủy. Cấy các chủng đã phân lập được trên môi trường dịch thể có thành phần giống như thành phần môi trường phân lập không có thạch. Mỗi chủng
cấy vào 1 ống nghiệm chứa 5ml môi trường với một lượng cấy tương đối bằng nhau (1 vòng que cấy), nuôi cấy trên máy lắc 24h. Dùng micropipet cấy dịch vi sinh vật trên môi trường thạch có thành phần giống như môi trường phân lập thành những giọt nhũ riêng rẽ. Nuôi cấy trong tủ ấm và quan sát vòng phân hủy. Lựa chọn những chủng có vòng phân hủy to và rõ.
2.3.5. Phương pháp phân lập vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật
Bước 1: Cân 10 g mẫu (đất…) cho vào cối sứ nghiền nhỏ, sau đó cho vào bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lý đã được khử trùng.
Bước 2: Lắc trên máy lắc trong thời gian 30 phút, sau đó để lắng. Ta có dung dịch mẫu pha loãng 10-1 lần.
Bước 3: Dùng pipetman hút 1ml dịch huyền phù ở độ pha loãng10-1 đưa vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng. Trộn đều ta có dịch pha loãng 10-2 lần.
Bước 4: Dùng pipetman hút 0,1 ml (100 µl) dịch huyền phù ở độ pha loãng10-2 đưa vào ống epppendorf chứa 0,9 ml nước cất vô trùng. Trộn đều ta có dịch pha loãng 10-3 lần.
Tiếp tục làm như trên, ta có một loạt độ pha loãng dịch mẫu khác nhau như ý.
Bước 5: Lấy 0,1 ml dịch ở các nồng độ từ 10-4 đến 10-6 nhỏ và dàn đều trên đĩa petri chứa môi trường KingB. Để trong tủ ấm ở nhiệt độ 280C, 370C trong 24h-48h sao cho có thể thấy rõ các khuẩn lạc riêng biệt.
Bước 6: Các khuẩn lạc có hình dạng, màu sắc khác nhau được tách riêng, làm thuần và giữ trong ống nghiệm để sử dụng cho các thí nghiệm sau.
Xác định khả năng sinh tổng hợp IAA thô: Đo hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng vi sinh vật phân lập bằng phương pháp Salkowski cải tiến (Misra và cs, 1989) sử dụng để xác định khả năng sinh tổng hợp IAA thô.
+ Vi sinh vật được nuôi cấy kỵ ánh sáng trên máy lắc tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 300C trong 48h trên môi trường nuôi cấy chuẩn có bổ sung tryptophan 0,1% (1g/1000ml môi trường).
+ Lấy 2ml dịch vi khuẩn đã ly tâm 3000 vòng/phút và bổ sung thêm 8ml thuốc thử Salkowski cải tiến. Quan sát thấy thuốc thử Salkowski cải tiến sẽ cho màu hồng nhạt đến đỏ phụ thuộc hàm lượng IAA thô được sinh ra.
Thuốc thử Salkowski:
FeCl3 0,5M: 15ml H2SO4 98%: 300ml Nước cất: 500ml
Định lượng xác định hàm lượng IAA thô được sinh ra: Hàm lượng IAA thô sinh ra được xác định theo phương pháp so màu ở bước sóng 530 nm với đồ thị chuẩn IAA.
+ Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp IAA thô (đã xác định theo phương pháp định tính ở trên) được nuôi cấy kỵ ánh sáng trên máy lắc tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 300C trên môi trường nuôi cấy chuẩn có bổ sung tryptophan 0,1%. Nuôi cấy và theo dõi hàm lượng IAA sinh ra sau thời gian là 2, 3, 4, 5 ngày.
+Dịch nuôi cấy vi sinh vật sau các thời gian nuôi cấy (2, 3, 4, 5 ngày) được ly tâm 3000 vòng/phút trong 25 phút. Sau ly tâm để yên dịch trong 20 phút rồi hút dịch đã ly tâm vào các lọ penicilin đã khử trùng và giữ trong tủ lạnh sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
+Dựng đồ thị chuẩn IAA: Cân 0.025g IAA cho vào cốc đong có chứa sẵn 50ml nước cất và đun cho tan IAA. Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa sẵn 10ml nước cất trong mỗi ống. Hút ở mỗi ống nghiệm lần lượt 0, 50, 100, 200, 400, 600,..., 1400, 1600 l nước cất đồng thời bổ sung lượng IAA tương ứng với lượng nước cất hút ra ở mỗi ống nghiệm. Đối chứng là 2ml nước cất bổ sung 8ml thuốc thử. Dựa vào chỉ số OD (mật độ quang) và nồng độ IAA trong dung dịch để dựng đồ thị chuẩn IAA tinh khiết.
+ Xác định hàm lượng IAA sinh ra: Thêm 2ml dung dịch vi sinh vật đã ly tâm vào ống nghiệm đã có sẵn 8ml thuốc thử. Đối chứng là 2ml môi trường và 8ml thuốc thử. So màu trên máy so màu bước sóng 530 nm và tính kết quả theo đồ thị chuẩn IAA tinh khiết.