CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phân lập và lưu giữ các chủng vi sinh vật từ mẫu đất
- Phân lập, lưu giữ các chủng vi sinh vật có ích từ mẫu đất thu thập tại các tỉnh Thanh Hóa, Nghệ An, Hà tĩnh.
2.2.2. Tuyển chọn và đánh giá các hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật có ích vi sinh vật có ích
- Xác định định tính hoạt tính CMC- aza (Williams, 1983) đối với chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenlulo.
- Xác định khả năng cố định nitơ của vi sinh vật: Định lượng khả năng cố định Nitơ bằng phương pháp Kjeldahl (theo Ridvan Kizilkaya, 2009).
- Xác định định tính khả năng phân hủy phốtpho vô cơ (theo TCVN 8565:2010), lựa chọn sơ bộ dựa trên độ lớn và độ trong của vòng phân hủy.
-Xác định khả năng tạo IAA thổ của các chủng vi sinh vật theo phương pháp đo màu được tạo thành với thuốc thử Van Urk Salkowski trong phương pháp của Salkowski.
2.2.3. Định danh chủng vi sinh vật phân giải xenlulo
- Sử dụng sinh học phân tử để định danh chủng vi sinh phân giải xenlulo dựa trên kết quả giải trình tự của gen 16S rRNA đặc trưng cho loài. 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Pha loãng mẫu và cấy trên môi trường đĩa thạch:
Bước 1: Cân 10 g mẫu (phân compost, rác thải, đất…) cho vào cối sứ nghiền nhỏ, sau đó cho vào bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lý đã được khử trùng.
Bước 2: Lắc trên máy lắc trong thời gian 30 phút, sau đó để lắng. Ta có dung dịch mẫu pha loãng 10-1 lần.
Bước 3: Dùng pipetman hút 1ml dịch huyền phù ở độ pha loãng10-1 đưa vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng. Trộn đều ta có dịch pha loãng 10-2 lần.
Bước 4: Dùng pipetman hút 0,1 ml (100 µl) dịch huyền phù ở độ pha loãng10-2 đưa vào ống epppendorf chứa 0,9 ml nước cất vô trùng. Trộn đều ta có dịch pha loãng 10-3 lần.
Tiếp tục làm như trên, ta có một loạt độ pha loãng dịch mẫu khác nhau như ý.
Bước 5: Lấy 0,1 ml dịch ở các nồng độ từ 10-4 đến 10-6 nhỏ và dàn đều trên đĩa petri chứa môi trường GauzeI và Hans. Để trong tủ ấm ở nhiệt độ 28oC, 37oC hoặc cao hơn (nếu muốn phân lập VSV chịu nhiệt) trong 24h-48h sao cho có thể thấy rõ các khuẩn lạc riêng biệt.
Bước 6: Các khuẩn lạc có hình dạng, màu sắc khác nhau được tách riêng, làm thuần và giữ trong ống nghiệm để sử dụng cho các thí nghiệm sau.
Các môi trường nuôi cấy trong nghiên cứu:
Môi trường NA: Meat extract 1g; Yeast extract 5g; pepton 5g; NaCl 5g.
Môi trường Ashby: Glucoze 20g ; K2HPO4 0,2g ; MgSO4.7H2O 0,2g ;NaCl 0,2g ; K2SO4 0,1g ; CaCO3 5g; Thạch 20g ; Nước cất 1000ml ; pH 7 - 7,2.
Môi trường King B: Yeast extract 5g; pepton 20g; glyxerin 5 ml; K2HPO4 (12,5%) 12 ml; MgS04.7H20 (6,25%) 25 ml; nước cất 1000 ml. pH 7.
Môi trường Pikovskaia: Glucoza 10g; yeast extract 0,5g; K2HPO4 o,5g; MgSO4 0,3g; Ca3(PO4)2 5g; dung dịch vi lượng 2ml; nước cất 1000ml. pH 7.
Môi trường AT: CaCO320g; Glucoza 20g; K2HPO40,8g; MgSO-4.7H2O 0,5g; KH2PO4 0,2g; FeCl3.6H2O 0,1g; Na2MoO4.2H2O 0,05g; nước
cất 1000ml. pH 7.
Môi trường Hans: K2HPO4: 0,5g; KH2PO4: 0,5g; (NH4)2SO4: 1g; MgSO4.7H2O: 0,1g; CaCl2: 0,1g; NaCl: 6g; Cao nấm men: 0,1g; CMC: 0,1g; Thạch: 12g; H2O: 1.000ml; pH=7.
Môi trường Gauze I: để phân lập và nhân sinh khối xạ khuẩn phân giải xenlulo K2HPO4: 0,5g; KH2PO4: 0,5g; MgSO4.7H2O: 0,5g; NaCl: 0,5g; KNO3: 1g; FeSO4.7H2O: 0,01g; Tinh bột tan: 20g; thạch: 12g; H2O: 1000ml; pH=7.
Môi trường gluco peptone agar (GPA): 1000ml; NaCl: 5g; Pepton: 10g; pH= 7,5.
Môi trường PDA: Glucoza: 20.0 g; Khoai tây: 200.0 g; Thạch: 15 g nước cất 1000 ml; pH=7.
Môi trường CMC đặc: CMC: 1g; Thạch: 12g; H2O: 1.000ml. Dung dịch nước muối sinh lý: NaCl: 0,85g; nước cất: 100ml
2.3.2. Phương pháp xác định định tính hoạt tính CMC- aza (Williams, 1983).
Sinh khối các chủng vi sinh vật sau khi nuôi cấy 48h được li tâm lắng gạn bỏ phần cặn lắng và nhỏ 1ml vào các lỗ thạch đã được chuẩn bị sẵn trên các đĩa Petri chứa môi trường CMC đặc (CMC: 1g; Thạch: 12g; H2O: 1.000 ml). Lưu giữ đĩa thạch trong tủ ấm 24 h, sau đó lấy ra và tráng bề mặt thạch bằng dung dịch lugol.
Hoạt tính sinh học được xác định bằng kích thước vòng phân giải, vòng tròn trong suốt bao quanh lỗ thạch ((hiệu số giữa đường kính vòng tròn trong suốt (D) và đường kính lỗ thạch (d).
2.3.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính cố định nitơ của vi sinh vật
Phương pháp so màu với thuốc thử Nessler theo Lê Văn Khoa (1996). Phương pháp xác định khả năng cố định nitơ của vi sinh vật: Định lượng khả năng cố định N bằng phương pháp Kjeldahl (theo Ridvan
Kizilkaya, 2009), sau khi nuôi cấy vi khuẩn Azotobacter trên môitrường Ashby dịch thể trong 72 giờ.
Phương pháp nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy và hình thái theo Nguyễn Lân Dũng (1998).
2.3.4. Phương pháp tuyển chọn vi sinh vật phân giải phốt pho
Lấy 10 g mẫu cho vào cối sứ nghiền nhỏ và đưa vào bình tam giác có chứa 90 ml nước cất vô trùng (độ pha loãng 10-1) lắc bằng máy lắc ở tốc độ 100 vòng/phút trong 15 phút. Hút 0,5 ml dịch cho vào ống nghiệm có chứa 4,5 ml nước cất vô trùng ta được nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục làm như vậy cho tới khi thu được độ pha loãng thích hợp. Lấy pipet vô trùng hút 0,1 ml dịch huyền phù từ các ống nghiệm có độ pha loãng thích hợp cho vào đĩa Petri có chứa môi trường Pikowskia. Gạt đều và ủ ở 30oC trong vài ngày cho tới khi xuất hiện khuẩn lạc. Với mỗi độ pha loãng cấy ra 3 đĩa. Sau khi xuất hiện khuẩn lạc trên các đĩa, đếm số khuẩn lạc vi sinh vật có vòng bao quanh. Đây chính là các vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất phốt pho vô cơ khó tan. Đồng thời đếm tổng số VSV có trên các môi trường tổng số để tính tần số bắt gặp vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất phốt pho vô cơ khó tan. Các khuẩn lạc này chưa đảm bảo thuần khiết về mặt di truyền và giữ mức độ ổn định hoạt tính cho nên cần phải giữ chúng trong các ống nghiệm giữ giống để làm sạch.Để làm sạch dùng que cấy vô trùng lấy một vòng que cấy sinh khối của giống cần làm sạch cho vào ống nghiệm chưa 4,5 ml nước cất vô trùng. Trộn đều và pha loãng tiếp cho đến khi đạt được độ pha loãng thích hợp. Hút 0,1 ml dịch huyền phù từ các độ pha loãng thích hợp nhỏ vào đĩa pettri có chứa môi trường Pikowskia gạt đều và ủ cho đến khi xuất hiện khuẩn lạc. Giữ các khuẩn lạc riêng rẽ có vòng trong bao quanh trong ống nghiệm giữ giống và tiếp tục làm sạch cho đến khi thu được giống thuần khiết. Cấy truyền những khuẩn lạc có vòng phân hủy sang ống nghiệm thạch nghiêng để giữ giống.
Đánh giá hoạt tính phân giải phốt phát của vi sinh vật (theo TCVN 8565:2010), Lựa chọn sơ bộ dựa trên độ lớn và độ trong của vòng phân hủy. Cấy các chủng đã phân lập được trên môi trường dịch thể có thành phần giống như thành phần môi trường phân lập không có thạch. Mỗi chủng
cấy vào 1 ống nghiệm chứa 5ml môi trường với một lượng cấy tương đối bằng nhau (1 vòng que cấy), nuôi cấy trên máy lắc 24h. Dùng micropipet cấy dịch vi sinh vật trên môi trường thạch có thành phần giống như môi trường phân lập thành những giọt nhũ riêng rẽ. Nuôi cấy trong tủ ấm và quan sát vòng phân hủy. Lựa chọn những chủng có vòng phân hủy to và rõ.
2.3.5. Phương pháp phân lập vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật
Bước 1: Cân 10 g mẫu (đất…) cho vào cối sứ nghiền nhỏ, sau đó cho vào bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lý đã được khử trùng.
Bước 2: Lắc trên máy lắc trong thời gian 30 phút, sau đó để lắng. Ta có dung dịch mẫu pha loãng 10-1 lần.
Bước 3: Dùng pipetman hút 1ml dịch huyền phù ở độ pha loãng10-1 đưa vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng. Trộn đều ta có dịch pha loãng 10-2 lần.
Bước 4: Dùng pipetman hút 0,1 ml (100 µl) dịch huyền phù ở độ pha loãng10-2 đưa vào ống epppendorf chứa 0,9 ml nước cất vô trùng. Trộn đều ta có dịch pha loãng 10-3 lần.
Tiếp tục làm như trên, ta có một loạt độ pha loãng dịch mẫu khác nhau như ý.
Bước 5: Lấy 0,1 ml dịch ở các nồng độ từ 10-4 đến 10-6 nhỏ và dàn đều trên đĩa petri chứa môi trường KingB. Để trong tủ ấm ở nhiệt độ 280C, 370C trong 24h-48h sao cho có thể thấy rõ các khuẩn lạc riêng biệt.
Bước 6: Các khuẩn lạc có hình dạng, màu sắc khác nhau được tách riêng, làm thuần và giữ trong ống nghiệm để sử dụng cho các thí nghiệm sau.
Xác định khả năng sinh tổng hợp IAA thô: Đo hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng vi sinh vật phân lập bằng phương pháp Salkowski cải tiến (Misra và cs, 1989) sử dụng để xác định khả năng sinh tổng hợp IAA thô.
+ Vi sinh vật được nuôi cấy kỵ ánh sáng trên máy lắc tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 300C trong 48h trên môi trường nuôi cấy chuẩn có bổ sung tryptophan 0,1% (1g/1000ml môi trường).
+ Lấy 2ml dịch vi khuẩn đã ly tâm 3000 vòng/phút và bổ sung thêm 8ml thuốc thử Salkowski cải tiến. Quan sát thấy thuốc thử Salkowski cải tiến sẽ cho màu hồng nhạt đến đỏ phụ thuộc hàm lượng IAA thô được sinh ra.
Thuốc thử Salkowski:
FeCl3 0,5M: 15ml H2SO4 98%: 300ml Nước cất: 500ml
Định lượng xác định hàm lượng IAA thô được sinh ra: Hàm lượng IAA thô sinh ra được xác định theo phương pháp so màu ở bước sóng 530 nm với đồ thị chuẩn IAA.
+ Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp IAA thô (đã xác định theo phương pháp định tính ở trên) được nuôi cấy kỵ ánh sáng trên máy lắc tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 300C trên môi trường nuôi cấy chuẩn có bổ sung tryptophan 0,1%. Nuôi cấy và theo dõi hàm lượng IAA sinh ra sau thời gian là 2, 3, 4, 5 ngày.
+Dịch nuôi cấy vi sinh vật sau các thời gian nuôi cấy (2, 3, 4, 5 ngày) được ly tâm 3000 vòng/phút trong 25 phút. Sau ly tâm để yên dịch trong 20 phút rồi hút dịch đã ly tâm vào các lọ penicilin đã khử trùng và giữ trong tủ lạnh sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
+Dựng đồ thị chuẩn IAA: Cân 0.025g IAA cho vào cốc đong có chứa sẵn 50ml nước cất và đun cho tan IAA. Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa sẵn 10ml nước cất trong mỗi ống. Hút ở mỗi ống nghiệm lần lượt 0, 50, 100, 200, 400, 600,..., 1400, 1600 l nước cất đồng thời bổ sung lượng IAA tương ứng với lượng nước cất hút ra ở mỗi ống nghiệm. Đối chứng là 2ml nước cất bổ sung 8ml thuốc thử. Dựa vào chỉ số OD (mật độ quang) và nồng độ IAA trong dung dịch để dựng đồ thị chuẩn IAA tinh khiết.
+ Xác định hàm lượng IAA sinh ra: Thêm 2ml dung dịch vi sinh vật đã ly tâm vào ống nghiệm đã có sẵn 8ml thuốc thử. Đối chứng là 2ml môi trường và 8ml thuốc thử. So màu trên máy so màu bước sóng 530 nm và tính kết quả theo đồ thị chuẩn IAA tinh khiết.
2.3.6. Phân loại vi sinh vật
Phân loại vi sinh vật bằng phương pháp giải trình tự: Sử dụng chương trình BLASTđể phát hiện những trình tự tương đồng với các trình tự nucleotit nghiên cứu đã được công bố trong ngân hàng dữ liệu trình tự gen (NCBI). Kết quả việc so sánh này sẽ chỉ ra loài vi sinh vật nghiên cứu thuộc chi, loài nào.
Phương pháp tiến hành: Tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn bằng: Tách chiết DNA tổng số từ vi sinh vật: chủng đơn vi sinh vật được làm sạch và nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng tổng sổ để đạt được mật độ tế bào cao. Sử dụng 2-3 ml dịch vi sinh vật để tiến hành tách chiến DNA tổng số bằng bộ kit GeneJET Genomic DNA Purification (K0721) của hãng Thermo. Sử dụng cặp mồi 16S, 18S rRNA để tiến hành phản ứng PCR với bộ kit PCR super mix (10572014). Sản phẩm PCR sau đó được gửi đi giải mã trình tự. Xác định tên loài, chi của vi sinh vật bằng cách so sánh đoạn trình tự nhân được với các trình tự đã công bố trên ngân hàng dự liệu gen NCBI để đánh giá sự tương đồng.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP VÀ LƯU GIỮ CÁC CHỦNG VI SINH VẬT TỪ MẪU ĐẤTTừ các mẫu đất thu thập ở ruộng lúa, ruộng mía tại tỉnh Hà Tĩnh; Nghệ Từ các mẫu đất thu thập ở ruộng lúa, ruộng mía tại tỉnh Hà Tĩnh; Nghệ An và từ Thanh Hóa đã phân lập được các chủng vsv thuộc các nhóm hoạt tính phân giải xenlullo, cố định nitơ, phân giải lân, kích thích sinh trưởng thực vật. Kết quả thể hiện chi tiết dưới đây:
3.1.1. Vi sinh vật phân giải xenlulo
Bằng phương pháp pha loãng mẫu và cấy trên môi trường đặc trưng nhằm sàng lọc vi sinh vật phân giải xenlulo, chúng tôi đã phân lập được 15 chủng vi sinh vật như (bảng 3.1)
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi sinh vật phân giải xenlulo phân lập từ các mẫu đất thu thập
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc TT Nguồn gốc Ký hiệu
Kích cỡ
PL chủng Hình dạng Màu sắc
(mm)
1 Thanh Hóa X-VDT1 Tròn, có viền đồng 3- 4 Trắng đục tâm
2 Thanh Hóa X-VDT2 Tròn, viền nhăn 3- 4 Trắng đục 3 Thanh Hóa X-VDT3 Tròn, dẹt nhăn mép 1- 2 Trắng
răng cưa bông
4 Thanh Hóa X-VDT4 Tròn, lồi nhầy 2- 3 Trong suốt 5 Thanh Hóa X-VDT5 Tròn, mép răng cưa 3- 4 Trắng
bông
7 Nghệ An X-VDT7 Tròn, viền nhăn 3- 4 Trắng đục 8 Nghệ An X-VDT8 Tròn, lồi, nhầy 3- 4 Trắng ngà 9 Nghệ An X-VDT9 Tròn, nhầy 3-4 Trắng đục 10 Nghệ An X-VDT10 Tròn, lồi, nhầy 2- 3 Trắng đục 11 Nghệ An X-VDT11 Tròn, mép răng cưa 3- 4 Trắng bông 12 Hà Tĩnh X-VDT12 Tròn, viền nhăn 3-4 Trắng 13 Hà Tĩnh X-VDT13 Tròn, lồi 2,5-3 Trắng sữa 14 Hà Tĩnh X-VDT14 Tròn, dẹt, có viền 3- 4 Trắng đục đồng tâm 15 Hà Tĩnh X-VDT15 Tròn, viền nhăn 1,5- 2 Trắng
Qua kết quả thu được ở bảng 3.1 cho thấy những chủng VSV có tiềm năng phân giải xenlulo gồm 05 chủng vi khuẩn (kí hiệu: X-VDT1, X- VDT2, X-VDT4, X-VDT5 và X-VDT13) còn lại là 10 chủng xạ khuẩn. Nhìn chung, các VSV phân lập được có hình dạng, kích thước và màu sắc khuẩn lạc rất đa dạng như: Tròn, lồi, dẹt, chủ yếu có màu trắng, trắng đục hay trắng ngà.
3.1.2. Vi sinh vật cố định nitơ
Tương tự bằng phương pháp pha loãng từ các mẫu đất thu thập, chúng tôi tiến hành phân lập và lựa chọn các vi sinh vật có khuẩn lạc mọc trên môi trường Ashby (môi trường không có nguồn dinh dưỡng – đạm). Các chủng vi khuẩn có khả năng phát triển được trên môi trường Ashby là các chủng vi khuẩn dự đoán có khả năng tự tổng hợp nitơ cho quá trình sinh trưởng, phát triển của chúng. Kết quả thực nghiệm được thể hiện trong bảng 3.2 dưới đây:
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng VSV có khả năng cố định nitơ
Nguồn gốc Ký hiệu Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
TT Kích cỡ
phân lập chủng Hình dạng Màu sắc (mm)
1 Nghệ An N-VDT1 Tròn, lồi, nhầy 1- 2 Trắng đục 2 Nghệ An N-VDT2 Tròn, lồi, nhầy 2- 3 Trắng trong
3 Nghệ An N-VDT3 Tròn, nhầy 3-4 Trắng đục
4 Nghệ An N-VDT4 Tròn, bề mặt 1,5- 2 Trắng đục lồi, nhày.
5 Thanh Hóa N-VDT5 Tròn, nhầy 2- 3 Trắng vàng 6 Thanh Hóa N-VDT6 Tròn, lồi, nhầy 2,5- 3 Trắng đục 7 Thanh Hóa N-VDT7 Tròn, lồi, nhầy 1,5- 2 Trắng ngà
8 Hà Tĩnh N-VDT8 Tròn, dẹt 3- 4 Trắng đục
9 Hà Tĩnh N-VDT9 Tròn, lồi, nhầy 2,5- 3 Trắng,nhân vàng 10 Hà Tĩnh N-VDT10 Tròn, nhầy 1,5- 2 Trắng,nhân
vàng
Từ các mẫu đất tại Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, 10 chủng vi sinh vật đã được phân lập trên môi trường Ashby. Các chủng này chúng tôi dự đoán