3. Nội dung nghiên cứu
1.4.2 Vai trò của apoptosis trong ung thư
Apoptosis được cho là đóng vai trò chính trong liệu pháp chống ung thư. Tổn thương tế bào thường dẫn tới sự ngừng tăng trưởng và ức chế khối u bằng cách gây ra apoptosis, hoại tử và lão hóa. Cơ chế chết tế bào phụ thuộc vào mức độ tổn thương DNA sau khi tiếp xúc với các nồng độ khác nhau của chất chống ung thư. Các tế bào kháng apoptosis và các con đường dẫn truyền ức chế quá trình apoptosis có thể ngăn cản tế bào chết theo chương trình apopotosis của tế bào cũng như ngăn cản sự lão hóa. Đáp ứng chống lại sự phát sinh ung thư là không đồng nhất tùy thuộc từng loại tế bào khác nhau, cũng như mức độ tổn thương tế bào cũng như loại tác nhân gây ung thư tác động lên tế bào. Hầu hết các thuốc chống ung thư thông thường hiện nay đều có độc tính gây chết tế bào theo con đường apopoptosis, trong khi đó, môt số loại thuốc nhắm đích ung thư mới thường hướng tới việc gây biệt hóa hoặc lão hóa tế bào nhưng ít gây
apoptosis tế bào. Cách tiếp tận mới này giúp cho cơ thể giảm thiểu được các tác động phụ do độc tính của thuốc gây ra [16].
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
Dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45 do phòng thí nghiệm Inserm U1053 - Viện Sức khỏe và nghiên cứu Y học Quốc gia Pháp tại Bordeaux cung cấp. Dòng tế bào được bảo quản trong nitơ lỏng tại Phòng thí nghiệm Nuôi cấy tế bào ung thư – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên.
Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: Môi trường nuôi cấy DMEMF12 và RPMI1640 (Invitrogen cung cấp), huyết thanh bò, trypsin, kháng sinh Penicillin/Streptomycin, DMSO (Sigma cung cấp).
Các đĩa nuôi cấy tế bào, ống pipette và một số dụng cụ nhỏ khác do Thermo Fisher cung cấp.
Hóa chất thí nghiệm vitamin C : Có nguồn gốc từ hãng Bio England. Các thí nghiệm được triển khai trên các hệ thống trang thiết bị hiện đại gồm:
- Buồng thao tác an toàn sinh học cấp II Thermo Fisher Scientific - Mỹ.
- Hệ thống kính hiển vi soi ngược Eclipse Ts2 NIKON -Nhật Bản.
- Hệ thống kính hiển vi huỳnh quang Eclipse Ti2-U NIKON -Nhật Bản.
- Tủ ấm CO2 Memmert – Đức + hệ thống cấp CO2.
- Hệ thống phân tích dòng chảy tế bào BD Accuri C6 Plus TM Flow Cytometer - Becton, Dickinson and Company, BD Biosciences– Mỹ.
- Các trang thiết bị phụ trợ hiện đại khác tại Phòng thí nghiệm Y sinh – Trường Đại học Khoa học.
Hình 2.1. Hệ thống kính hiển vi soi ngược
Hình 2.3. Hệ thống phân tích dòng chảy tế bào
Hình 2.4. Buồng thao tác an toàn sinh học cấp II Thermo Fisher Scientific - Mỹ
2.2. Địa điểm và thời gian
Nghiên cứu được thực hiện tại các phòng Thí nghiệm Y Sinh – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên.
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 01/2019 đến tháng 08/2019.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nuôi cấy tế bào ung thư 2D và xử lý với Vitamin C
Môi trường nuôi cấy: Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào động vật trong điều kiện bám dính gồm có: Môi trường nuôi cấy RPMI 1640, 10% huyết thanh bò có chửa (FBS) và 1% kháng sinh Penicillin/Streptomicin (P/S).
Nuôi cấy tế bào: Các tế bào được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng, tiếp theo mỗi giếng được bổ sung 100 µl môi trường nuôi cấy đã được chuẩn bị ở trên. Đĩa nuôi cấy được đưa vào trong tủ nuôi cấy CO2 và nuôi cấy ở nhiệt độ 370C, 5% CO2.
* Phương pháp xử lý tế bào với vitamin C
Tế bào ung thư dạ dày sau 24h nuôi cấy, đã bám dính trên bề mặt đĩa sẽ được tiến hành xử lý vitamin C lần lượt ở các nồng độ khác nhau từ 0,5mM; 1mM; 2 mM; 5 mM; 10 mM thời gian xử lý trong 24h, 48h hoặc 120h tùy theo từng thí nghiệm cụ thể.
+ Các giếng đối chứng: Không xử lý với vitamin C (0 mM).
+ Các giếng thí nghiệm: Lần lượt được xử lý với vitamin C ở các nồng độ từ 0,5 – 10 mM.
Mỗi nồng độ khác nhau (kể cả đối chứng) được xử lý gồm 3 giếng và thí nghiệm này được lặp lại 3 lần.
Quan sát sự thay đổi hình dạng và phân tích số lượng tế bào bằng kính hiển vi soi ngược NIKON Ts2 và kiểu nhân tế bào (nhuộm DAPI) kính hiển vi huỳnh quang NIKON T2U sau 24h, 48h và 120h.
2.3.2. Phân tích sự tăng sinh tế bào bằng phương pháp MTT
MTT khảo nghiệm là một xét nghiệm đo màu để đánh giá hoạt động trao đổi chất của tế bào. Enzyme oxyoreductase tế bào phụ thuộc H của NAD (P) có thể, trong các điều kiện xác định, phản ánh số lượng tế bào khả thi hiện diện. Những enzyme này có khả năng làm giảm thuốc nhuộm tetrazolium MTT 3- (4,5- di methyl thiazol -2-yl) -2,5-di phenyl tetrazolium bromide thành formazan không hòa tan của nó, có màu tím. Các thuốc nhuộm tetrazolium liên quan chặt chẽ khác bao gồm XTT, MTS và WST, được sử dụng cùng với chất nhận điện tử trung gian, 1-methoxy phenazine methosulfate (PMS). Với WST-1, không thấm được tế bào, sự khử xảy ra bên ngoài tế bào thông qua sự vận chuyển điện tử màng plasma. Các xét nghiệm nhuộm Tetrazolium cũng có thể được sử dụng để đo độc tính tế bào (mất tế bào khả thi) hoặc hoạt động tế bào học (chuyển từ tăng sinh sang hoạt động) của các tác nhân dược phẩm và vật liệu độc hại. Các xét nghiệm MTT thường được thực hiện trong bóng tối vì thuốc thử MTT rất nhạy cảm với ánh sáng [53].
Các dòng tế bào được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng (đáy bằng) ở mật độ 5x103 tế bào/giếng, thể tích nuôi cấy là 100 µl/giếng. Sau 48 giờ tế bào được xử lý bằng môi trường mới chứa DCLK ở các nồng độ từ 10 - 500 µg/ml. Thời gian xử lý là 48 giờ, sau đó, bổ sung 20 µl dung dịch MTT trong 4 giờ. Tiếp theo, dung dịch nuôi cấy chứa hóa chất MTT được loại bỏ hoàn toàn và được thay thế bởi 100 µl dung môi và 12 µl dung dịch đệm: 0,1 M NaCl; 0,1 M glycine; pH = 10 và tiếp tục ủ 15 phút. Mật độ quang (optical density) của mỗi giếng được đo bằng máy quang phổ nano (SPECTROstarNano) ở bước sóng 570
% Tế bào sống so với đối chứng = (Mật độ quang giếng xử lý/Mật độ quang giếng đối chứng)*100
Trong đó, tỷ lệ tế bào sống ở giếng đối chứng được coi là 100%, mỗi nồng độ được xử lý có số lần lặp lại n = 8 (8 giếng cho một nồng độ).
2.3.3. Phân tích chu kỳ tế bào và apoptosis bằng Flow cytometry
Theo phương pháp của Riccardi & Nicoletti (2006) [45] : 2x105 tế bào của mỗi dòng được nuôi cấy trên đĩa loại 12 giếng. Sau 24 giờ, tế bào được xử lý bằng môi trường nuôi cấy chứa DCLK ở nồng độ 100 µg/ml. Các giếng đối chứng không bổ sung dịch chiết. Thời gian xử lý là 48 giờ trong điều kiện 370C, 5% CO2. Tiếp theo, các tế bào được tách khỏi bề mặt đĩa bằng cách xử lý với trysin/EDTA và được thu lại bằng ly tâm 1300 vòng/phút trong 3 phút, sau đó được nhuộm với dung dịch Fluorochrom (0,1% sodium citrate (wt/v); 0,1% Triton X-100 (v/v), 50 mg l-1 PI trong nước khử ion vô trùng) trong thời gian 2 giờ ở 40C trước khi phân tích bằng hệ thống dòng tế bào BD-Canto II. Kết quả dữ liệu được phân tích bằng phần mềm BD FACS Diva 6.1.1.
2.3.4. Phân tích khả năng di cư của tế bào
Các tế bào được nuôi cấy bám dính như đã trình bày trong mục 2.3.1. Khi mật độ tế bào đạt đến 80 -90% trên bề mặt đĩa nuôi cấy, một đường danh giới được thiết lập bằng cách sử đụng đầu côn vạch theo thước kẻ. Tiếp theo, các giếng nuôi cấy được rửa lại bằng PBS để loại bỏ các tế bào không bám dính trước khi tiến hành xử lý các giếng tế bào với vitamin C ở nồng độ khác nhau. Sau 48h xử lý với thuốc, các giếng tế bào được chụp ảnh dưới kính hiển vi soi người ở cùng một độ phóng đại 80X. Quan sát sự thu hẹp dải phân cách do quá trình di trú của tế bào.
Nuôi cấy các tế bào ung thư dạ dày MKN45 với mật độ 2.000 tế bào/giếng nuôi cấy có diện tích 3,8 cm2, bề mặt không bám dính để hình thành nên tumorsphere (khối tế bào ung thư hình cầu).
Sử dụng môi trường DMEMF12/Glutamax có bổ sung 1% ampinicillin/streptomycin, yếu tố tăng trưởng biểu mô EGF 20 ng/ml, yếu tố tăng trưởng thượng bì FGF 20ng/ml, 0,3% glucose, 5µg/ml insulin ở 370C, 5% CO2. Mỗi 2 ngày của quá trình nuôi cấy, loại bỏ 1 ml môi trường nuôi cấy cũ, đồng thời bổ sung 1 ml môi trường nuôi cấy mới. Các tế bào trước khi nuôi cấy tumorsphere được xử lý với vitamin C ở các nồng độ khác nhau từ 0,5 – 2mM. Đối chứng không xử lý với vitamin C.
2.3.6. Phương pháp xử lí số liệu
Phân tích giá trị khác biệt về mặt thống kê giữa các nhóm đối chứng và nhóm kiểm định theo Mann Whitney, sử dụng phần mềm GraphPad Prism 5.0.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tác động của vitamin C lên sự tăng sinh tế bào
Để đánh giá ảnh hưởng của vitamin C lên sự tăng sinh của tế bào ung thư dạ dày MKN45, chúng tôi tiến hành xử lí các tế bào MKN45 với 5 nồng độ khác nhau: 0,5 mM, 1mM, 2mM, 5mM và 10 mM trong 3 khoảng thời gian 24h, 48h và 120h. Các mẫu xử lí được so sánh với đối chứng. Kết quả đánh giá tác động của vitamin C lên sự tăng sinh tế bào trong dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45 bằng kỹ thuật MTT được thể hiện ở hình 3.1.
Kết quả trong hình 3.1 cho thấy, tỉ lệ sống sót của các tế bào MNK45 phụ thuộc vào nồng độ vitamin C và thời gian xử lí. Khi xử lí tế bào MKN45 với nồng độ vitamin C là 0,5 mM, trong 3 mốc thời gian là 24 giờ, 48 giờ và 120h. Ở cả 3 mốc thời gian xử lí, số lượng tế bào không có sự thay đổi đáng kể so với đối chứng. Như vậy, ở nồng độ 0,5 mM vitamin C không ảnh hưởng rõ rệt đến sự tăng tế bào MKN45.
Xử lí tế bào MKN45 với nồng độ vitamin C là 1 mM, trong 3 mốc thời gian xử lí, ở mức 24 giờ không nhận thấy có sự thay đổi về tỷ lệ sống của tế bào giữa mẫu đối chứng và mẫu xử lí. Sau 48 giờ tỷ lệ tế bào sống là khoảng 95% so với đối chứng, và sau 120h có sự thay đổi rõ rệt về tỷ lệ sống sót giảm xuống còn 90% so với đối chứng ban đầu.
Khi xử lý tế bào ở nồng độ 2mM, chỉ sau 24h đã có sự giảm đáng kể về tỷ lệ tế bào sống ở mẫu xử lí so với đối chứng. Đặc biệt sau 120h, tỷ lệ tế bào sống ở mẫu xử lí còn khoảng 57% so với đối chứng.
Xử lí tế bào MKN45 với vitamin C ở nồng độ 5 mM cũng đã chỉ ra sự giảm rõ rệt về số lượng tế bào chỉ sau 24h. Tế bào ở mẫu xử lý giảm mạnh so với đối chứng sau 48h và 120h, tương ứng với tỷ lệ tế bào sống so với đối chứng chỉ còn khoảng 60% (48h) và 25% (sau 120h).
Ở nồng độ cao nhất trong dãy nồng độ nghiên cứu (10mM), có sự giảm mạnh về số lượng tế bào ngay sau 24h xử lí, tương ứng với các tỷ lệ tế bào sống là 55% (ở mốc 24h), 30% (ở mốc 48h) và khoảng 10% (ở mốc 120h) so với đối chứng.
Như vậy, khi xử lý tế bào MKN45 ở nồng độ cao ở 5 mM và 10 mM trong thời gian ngắn đã cho thấy có sự giảm mạnh về số lượng tế bào sống sót, điều này đồng nghĩa với việc vitamin C gây ức chế tế bào theo nồng độ và theo thời gian.
Một nghiên cứu của Zhang và các đồng nghiệp cũng cho thấy vitamin C gây ức chế sự tăng trưởng của các dòng tế bào ung thư dạ dày AGS và MKN45. Vitamin C gây ra sự ức chế tăng trưởng theo cơ chế ức chế sự tổng hợp protein và tổng hợp DNA trong các tế bào dạ dày AGS và MKN45. Ở nồng độ tương tự trong dịch dạ dày của các đối tượng khỏe mạnh (≥50 M), vitamin C đã gây độc tế bào rõ rệt cho các tế bào này và ảnh hưởng lên sự tổng hợp protein và DNA của tế bào. Tuy nhiên, hiệu quả đã giảm đáng kể ở mức tương tự như trong dịch dạ dày của bệnh nhân nhiễm H pylori (<50 μM). Nghiên cứu này cũng đánh giá mối quan hệ giữa nồng độ tế bào và ức chế tăng trưởng tế bào AGS do vitamin C. Hiệu quả của vitamin C đối với khả năng sống của tế bào AGS được so sánh giữa các tế bào được xử lý trong 24 đĩa giếng ( nồng độ 1 × 10 5/ml) và trong các đĩa 96 giếng ( nồng độ 1 × 10 4/ml). Sau 72 giờ ủ, vitamin C chỉ gây ức 2,4 % trong 24 đĩa giếng với nồng độ vitamin C 400 μM nhưng ức chế 3,7 % trong 96 đĩa giếng với nồng độ vitamin C 200 μM (p < 0,0001). Phát hiện này cho thấy rằng sự tác động của vitamin C phụ thuộc cả vào mật độ tế bào dạ [67].
Trong nghiên cứu của Xisu và cộng sự vào năm 2019, Vitamin C giết chết các tế bào ung thư tuyến giáp thông cơ chế phụ thuộc ROS và con đường MAPK/ERK và PI3K/AKT. Tác dụng của vitamin C đối với sự tăng sinh tế
phân tích dòng chảy tế bào. Vitamin C đã được chứng minh có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư đại trực tràng đột biến BRAF một cách chọn lọc. Đột biến BRAF là sự thay đổi di truyền phổ biến nhất trong sự phát triển và tiến triển của khối u tuyến giáp. Tuy nhiên, hiệu quả chống ung thư của vitamin C trong ung thư tuyến giáp vẫn còn được khám phá. Các phân tích sâu hơn bằng phân tử và sinh hóa cũng đã được sử dụng để làm sáng tỏ các cơ chế hoạt động chống ung thư của vitamin C trong ung thư tuyến giáp [54].
3.2. Tác động của vitamin C lên kiểu hình tế bào
Để đánh giá ảnh hưởng của vitamin C lên kiểu hình tế bào MNK45, các tế bào nuôi cấy được xử lý trong 120h ở các nồng độ 0,5mM, 1 mM, 2 mM, 5 mM, và 10 mM. Kết quả được trình bày trong hình 3.2.
Kết quả cho thấy đã có sự thay đổi hình thái tế bào được xử lý so với đối chứng. Trong hình đối chứng hình thái ban đầu các tế bào có hình thoi dài hoặc ovan điển hình, các tế bào phân bố đều và bám dính trên bề mặt nuôi cấy.
Kết quả từ hình 3.2 cho thấy, ở giếng đối chứng, các tế bào tăng sinh nhanh chóng và phủ kín bề mặt đĩa nuôi cấy. Các tế bào xếp liên tiếp nhau và có hình dạng đồng đều. Ở nồng độ thấp từ 0,5mM – 1mM có rất ít sự thay đổi về mặt số lượng và hình thái tế bào so với đối chứng. Tuy nhiên, sự thay đổi rõ rệt về mật độ và hình thái tế bào ở nồng độ xử lí ở nồng độ 2mM trở lên. Tế bào bị xử lý có hiện tượng co tròn và mất khả năng bám dính trên bề mặt của đĩa nuôi cấy.
Các tế bào được xử lí với vitamin C ở mức nồng độ 10 mM, theo quan sát nhận thấy, các tế bào bị biến đổi hoàn toàn về hình dạng và có hiện tượng tan rã thành các tế bào đơn, mất khả năng bám dính trên bề mặt đĩa và trôi nổi trong dịch nuôi cấy, như vậy ở mức nồng độ 10 mM các tế bào nuôi cấy đã bị tan rã và có nhiều tế bào chết trên bề mặt nuôi cấy.
Các tế bào được xử lí với vitamin C ở các nồng độ làm hình thái thông thường của tế bào đã bị biến đổi sau xử lý và sự thay đổi có liên quan đến sự phân chia và tăng sinh tế bào.
Các nghiên cứu của Qi Chen và các cộng sự đã cho thấy liệu vitamin C có khả tiêu diệt tế bào ung thư một cách chọn lọc. Sự chết tế bào ở 10 bệnh ung