3. Nội dung nghiên cứu
2.3.6. Phương pháp xử lí số liệu
Phân tích giá trị khác biệt về mặt thống kê giữa các nhóm đối chứng và nhóm kiểm định theo Mann Whitney, sử dụng phần mềm GraphPad Prism 5.0.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tác động của vitamin C lên sự tăng sinh tế bào
Để đánh giá ảnh hưởng của vitamin C lên sự tăng sinh của tế bào ung thư dạ dày MKN45, chúng tôi tiến hành xử lí các tế bào MKN45 với 5 nồng độ khác nhau: 0,5 mM, 1mM, 2mM, 5mM và 10 mM trong 3 khoảng thời gian 24h, 48h và 120h. Các mẫu xử lí được so sánh với đối chứng. Kết quả đánh giá tác động của vitamin C lên sự tăng sinh tế bào trong dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45 bằng kỹ thuật MTT được thể hiện ở hình 3.1.
Kết quả trong hình 3.1 cho thấy, tỉ lệ sống sót của các tế bào MNK45 phụ thuộc vào nồng độ vitamin C và thời gian xử lí. Khi xử lí tế bào MKN45 với nồng độ vitamin C là 0,5 mM, trong 3 mốc thời gian là 24 giờ, 48 giờ và 120h. Ở cả 3 mốc thời gian xử lí, số lượng tế bào không có sự thay đổi đáng kể so với đối chứng. Như vậy, ở nồng độ 0,5 mM vitamin C không ảnh hưởng rõ rệt đến sự tăng tế bào MKN45.
Xử lí tế bào MKN45 với nồng độ vitamin C là 1 mM, trong 3 mốc thời gian xử lí, ở mức 24 giờ không nhận thấy có sự thay đổi về tỷ lệ sống của tế bào giữa mẫu đối chứng và mẫu xử lí. Sau 48 giờ tỷ lệ tế bào sống là khoảng 95% so với đối chứng, và sau 120h có sự thay đổi rõ rệt về tỷ lệ sống sót giảm xuống còn 90% so với đối chứng ban đầu.
Khi xử lý tế bào ở nồng độ 2mM, chỉ sau 24h đã có sự giảm đáng kể về tỷ lệ tế bào sống ở mẫu xử lí so với đối chứng. Đặc biệt sau 120h, tỷ lệ tế bào sống ở mẫu xử lí còn khoảng 57% so với đối chứng.
Xử lí tế bào MKN45 với vitamin C ở nồng độ 5 mM cũng đã chỉ ra sự giảm rõ rệt về số lượng tế bào chỉ sau 24h. Tế bào ở mẫu xử lý giảm mạnh so với đối chứng sau 48h và 120h, tương ứng với tỷ lệ tế bào sống so với đối chứng chỉ còn khoảng 60% (48h) và 25% (sau 120h).
Ở nồng độ cao nhất trong dãy nồng độ nghiên cứu (10mM), có sự giảm mạnh về số lượng tế bào ngay sau 24h xử lí, tương ứng với các tỷ lệ tế bào sống là 55% (ở mốc 24h), 30% (ở mốc 48h) và khoảng 10% (ở mốc 120h) so với đối chứng.
Như vậy, khi xử lý tế bào MKN45 ở nồng độ cao ở 5 mM và 10 mM trong thời gian ngắn đã cho thấy có sự giảm mạnh về số lượng tế bào sống sót, điều này đồng nghĩa với việc vitamin C gây ức chế tế bào theo nồng độ và theo thời gian.
Một nghiên cứu của Zhang và các đồng nghiệp cũng cho thấy vitamin C gây ức chế sự tăng trưởng của các dòng tế bào ung thư dạ dày AGS và MKN45. Vitamin C gây ra sự ức chế tăng trưởng theo cơ chế ức chế sự tổng hợp protein và tổng hợp DNA trong các tế bào dạ dày AGS và MKN45. Ở nồng độ tương tự trong dịch dạ dày của các đối tượng khỏe mạnh (≥50 M), vitamin C đã gây độc tế bào rõ rệt cho các tế bào này và ảnh hưởng lên sự tổng hợp protein và DNA của tế bào. Tuy nhiên, hiệu quả đã giảm đáng kể ở mức tương tự như trong dịch dạ dày của bệnh nhân nhiễm H pylori (<50 μM). Nghiên cứu này cũng đánh giá mối quan hệ giữa nồng độ tế bào và ức chế tăng trưởng tế bào AGS do vitamin C. Hiệu quả của vitamin C đối với khả năng sống của tế bào AGS được so sánh giữa các tế bào được xử lý trong 24 đĩa giếng ( nồng độ 1 × 10 5/ml) và trong các đĩa 96 giếng ( nồng độ 1 × 10 4/ml). Sau 72 giờ ủ, vitamin C chỉ gây ức 2,4 % trong 24 đĩa giếng với nồng độ vitamin C 400 μM nhưng ức chế 3,7 % trong 96 đĩa giếng với nồng độ vitamin C 200 μM (p < 0,0001). Phát hiện này cho thấy rằng sự tác động của vitamin C phụ thuộc cả vào mật độ tế bào dạ [67].
Trong nghiên cứu của Xisu và cộng sự vào năm 2019, Vitamin C giết chết các tế bào ung thư tuyến giáp thông cơ chế phụ thuộc ROS và con đường MAPK/ERK và PI3K/AKT. Tác dụng của vitamin C đối với sự tăng sinh tế
phân tích dòng chảy tế bào. Vitamin C đã được chứng minh có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư đại trực tràng đột biến BRAF một cách chọn lọc. Đột biến BRAF là sự thay đổi di truyền phổ biến nhất trong sự phát triển và tiến triển của khối u tuyến giáp. Tuy nhiên, hiệu quả chống ung thư của vitamin C trong ung thư tuyến giáp vẫn còn được khám phá. Các phân tích sâu hơn bằng phân tử và sinh hóa cũng đã được sử dụng để làm sáng tỏ các cơ chế hoạt động chống ung thư của vitamin C trong ung thư tuyến giáp [54].
3.2. Tác động của vitamin C lên kiểu hình tế bào
Để đánh giá ảnh hưởng của vitamin C lên kiểu hình tế bào MNK45, các tế bào nuôi cấy được xử lý trong 120h ở các nồng độ 0,5mM, 1 mM, 2 mM, 5 mM, và 10 mM. Kết quả được trình bày trong hình 3.2.
Kết quả cho thấy đã có sự thay đổi hình thái tế bào được xử lý so với đối chứng. Trong hình đối chứng hình thái ban đầu các tế bào có hình thoi dài hoặc ovan điển hình, các tế bào phân bố đều và bám dính trên bề mặt nuôi cấy.
Kết quả từ hình 3.2 cho thấy, ở giếng đối chứng, các tế bào tăng sinh nhanh chóng và phủ kín bề mặt đĩa nuôi cấy. Các tế bào xếp liên tiếp nhau và có hình dạng đồng đều. Ở nồng độ thấp từ 0,5mM – 1mM có rất ít sự thay đổi về mặt số lượng và hình thái tế bào so với đối chứng. Tuy nhiên, sự thay đổi rõ rệt về mật độ và hình thái tế bào ở nồng độ xử lí ở nồng độ 2mM trở lên. Tế bào bị xử lý có hiện tượng co tròn và mất khả năng bám dính trên bề mặt của đĩa nuôi cấy.
Các tế bào được xử lí với vitamin C ở mức nồng độ 10 mM, theo quan sát nhận thấy, các tế bào bị biến đổi hoàn toàn về hình dạng và có hiện tượng tan rã thành các tế bào đơn, mất khả năng bám dính trên bề mặt đĩa và trôi nổi trong dịch nuôi cấy, như vậy ở mức nồng độ 10 mM các tế bào nuôi cấy đã bị tan rã và có nhiều tế bào chết trên bề mặt nuôi cấy.
Các tế bào được xử lí với vitamin C ở các nồng độ làm hình thái thông thường của tế bào đã bị biến đổi sau xử lý và sự thay đổi có liên quan đến sự phân chia và tăng sinh tế bào.
Các nghiên cứu của Qi Chen và các cộng sự đã cho thấy liệu vitamin C có khả tiêu diệt tế bào ung thư một cách chọn lọc. Sự chết tế bào ở 10 bệnh ung thư và 4 loại tế bào bình thường đánh giá sau 1h xử lý với vitamin C ở các nồng độ khác nhau. Kết quả phân tích đã chỉ ra rằng, các tế bào bình thường không bị ảnh hưởng bởi vitamin C ở nồng độ nồng độ 20mM, trong khi đó 5 dòng ung thư bị tác động mạnh và có giá trị IC50 < 4 mM. nghiên cứ này cũng đã chỉ ra nằng các tế bào ung thư hạch ở người đã được chỉ ra là nhạy cảm với vitamin C (IC50 =0,5 mM). Những phát hiện này chỉ ra giá trị của vitamin C ứng dụng trong điều trị ung thư giảm nguy cơ bị nhiễm trùng [43].
3.3. Ảnh hưởng của vitamin C lên chu kỳ tế bào
Các kết quả phân tích về sự tăng trưởng và hình thái tế bào đã chỉ ra ảnh hưởng ức chế của vitamin C lên tế bào ung thư MKN45. Để tìm ra cơ chế của sự tác động đó, chúng tôi tiếp tục đánh giá ảnh hưởng của vitamin C lên chu kỳ tế bào. Trong nghiên cứu này, tế bào được xử lí với vitamin C và được phân tích chu kỳ tế bào bằng phương pháp phân tích dòng chảy tế bào. Kết quả phân tích được chỉ ra trong hình 3.3.
Đối với các tế bào đối chứng số lượng tế bào ở pha G0/G1 được xác định là khoảng 65%, số lượng tế bào ở pha S là khoảng 10%, ở pha G2/M là khoảng 25%. Đối với tế bào xử lí với vitamin C ở nồng độ 0,5 mM, số lượng ở pha G0/G1 không có sự khác biệt, ở pha S tăng và pha G2/M giảm tế bào có sự thay đổi với đối chứng.
Đối với tế bào xử lí với vitamin C ở nồng độ 0,5mM - 1 mM, số lượng ở pha G0/G1 không có sự khác biệt, ở pha S tăng so với đối chứng.
Đối với tế bào xử lí với vitamin C ở nồng độ 2 mM, số lượng ở pha G0/G1 tăng số lượng tế bào (79,1%) so với đối chứng ( 64,7%), ở pha G2/M số lượng tế bào giảm so với đối chứng.
Như vậy, vitamin C đã dừng chu kỳ phân chia của tế bào ở pha G0/G1. Wang cùng cộng sự đã nghiên cứu Metformin dừng chu kỳ tế bào pha G0/G1 trong trường hợp của u tủy bằng cách nhắm mục tiêu các con đường AMPK/mTORC1 và mTORC2. Các tế bào RPMI8226 và U266 được gieo xử lý với metformin ở nồng độ 5 mM và 20 mM trong 24 và 48 giờ. Các tế bào sau đó được xử lý với propidium iodide, sau đó được phân tích bằng phương pháp tế bào học dòng chảy tế bào [57]. Kết quả phân tích đã cho thấy các tế bào tích lũy trong pha G0 / G1, trong khi tỷ lệ các tế bào trong pha S giảm. Tiếp theo đó, phân tích Western blot cho thấy rõ sự điều hòa giảm của cyclin D1, trong khi p21 CIP1 và p27 KIP1 đã được biểu hiện tăng. Những kết quả này chỉ ra rằng metformin đã ức chế sự phát triển của các tế bào RPMI8226 và U266 bằng cách ngăn chặn sự tiến triển của chu kỳ tế bào trong pha G0/G1. Nghiên cứu chỉ ra rằng metformin ức chế sự tăng sinh của các tế bào u nguyên bào bằng cảm ứng thực bào và dừng chu kỳ tế bào ở pha G0/G1 thông qua một cơ chế có thể liên quan đến việc ức chế kép con đường mTORC1 và mTORC2 qua trung gian kích hoạt AMPK [61].
3.4. Ảnh hưởng của vitamin C lên apoptosis của tế bào
Kết quả phân tích apoptosis được chỉ ra trong hình 3.4. Kết quả phân tích apoptosis cho thấy, sau 48h xử lí tế bào với vitamin C ở các nồng độ khác nhau từ 0,5 – 2mM, không có sự thay đổi rõ rệt nào về tỷ lệ % tế bào apoptosis giữa đối chứng (0mM) với mẫu xử lý (0,5 – 2mM). Như vậy rõ ràng vitamin C đã ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư dạ dày không theo cách cảm ứng quá trình apoptosis. Nhiều thuốc chống ung thư hiện nay có cơ chế ức chế ung thư bằng cách cảm ứng quá trình chết apoptosis của tế bào. Sự giết chết tế bào theo con đường apoptosis thể hiện độc tính của thuốc chống ung thư. Một số loại
thuốc mới tiềm năng như metformin, vitramin A hoặc một số hợp chất có nguồn gốc từ tự nhiên lại được chỉ ra là ít gây độc cấp cho tế bào nhưng lại ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư theo cách gây lão hóa hoặc biệt hóa tế bào.
Tuy nhiên, một số phân tích tác động của viamin C lên các loại tế bào ung thư khác như ung thư vú và ung thư ruột đã chỉ ra rằng viatimin đã làm tăng tế bào chết theo con đường apoptosis bằng cách phá vỡ màng ti thể hoặc hoạt hóa biểu hiện tăng cường của protein TRAIL [27] [31]. Tuy nhiên, đối với một số dạng ung thư khác, vitamin C lại ức chế sự tăng sinh của tế bào bằng cách gây lão hóa tế bào [60].
Các nghiên cứu của Ryungsa Kim và các cộng sự đã làm rõ mối liên hệ giữa apoptosis và kết quả điều trị. Mặc dù apoptosis được cho là đóng vai trò chính trong liệu pháp chống ung thư, nhưng sự liên quan lâm sàng của việc gây ra apoptosis vẫn không chắc chắn, đặc biệt là trong các khối u rắn. Việc gây ra apoptosis bằng các tác nhân chống ung thư đã được chứng minh là có liên quan đến phản ứng của khối u, tuy nhiên, các hình thức chết tế bào không gây dị ứng, chẳng hạn như autophagy và lão hóa ngoại sinh, cũng đã được chứng minh là góp phần vào phản ứng khối u nói chung. Tổn thương tế bào gây ra sự ngừng tăng trưởng và ức chế khối u bằng cách gây ra apoptosis, hoại tử và lão hóa, cơ chế chết tế bào phụ thuộc vào mức độ tổn thương DNA sau khi tiếp xúc với các nồng độ khác nhau của chất chống ung thư. Các tế bào kháng apoptosis và các con đường dẫn truyền ức chế quá trình apoptosis có thể gây ra các cơ chế nonapoptotic của tế bào chết và lão hóa, do đó bảo tồn tác dụng chống ung thư của một số tác nhân chống ung thư. Phản ứng chống ung thư không đồng nhất bao gồm các loại tế bào chết tế bào khác nhau, tùy thuộc vào mức độ tổn thương tế bào hoặc DNA phát sinh bởi các tế bào ung thư. Là một chiến lược điều trị mới, các loại tế bào chết thay thế có thể được khai thác để kiểm soát và tiêu diệt các tế bào ung thư. Nghiên cứu đã thảo luận về ý nghĩa lâm sàng của apoptosis, cũng như sự đóng góp tiềm năng của các loại chết tế bào khác đối
với sự nhạy cảm của khối u nói chung với hy vọng rằng các chiến lược điều trị mới có thể theo sau. Phản ứng chống ung thư không đồng nhất bao gồm các loại tế bào chết tế bào khác nhau, tùy thuộc vào mức độ tổn thương tế bào hoặc DNA phát sinh bởi các tế bào ung thư. Là một chiến lược điều trị mới, các loại tế bào chết thay thế có thể được khai thác để kiểm soát và tiêu diệt các tế bào ung thư. Phản ứng chống ung thư không đồng nhất bao gồm các loại tế bào chết tế bào khác nhau, tùy thuộc vào mức độ tổn thương tế bào hoặc DNA phát sinh bởi các tế bào ung thư, các loại tế bào chết thay thế có thể được khai thác để kiểm soát và tiêu diệt các tế bào ung thư [48].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nhận thấy rằng ảnh hưởng của vitamin C lên apopotosis là không đáng kể, rất có thể nó gây chết tế bào ở nồng độ xử lý cao theo một cơ chế lão hóa hoặc stress tế bào và cần có nghiên cứu tiếp theo để lãm rõ hơn.
3.5. Ảnh hưởng của vitamin C lên sự di trú của tế bào
Để đánh giá ảnh hưởng của vitamin C lên sự di trú của tế bào, chúng tôi tiến hành xử lí các tế bào MKN45 ở nồng độ 0,5- 2mM, so với đối chứng và tế bào trước khi được xử lý. Kết quả được thể hiện ở hình 3.5.
Kết quả thử nghiệm cho thấy, ở mẫu tế bào được xử lý với vitamin C nồng độ 0,5 – 1mM, mức độ di trú của các tế bào vào vùng phân cách không có sự khác biệt lớn. Hay nói cách khác, tốc độ tăng trưởng và xâm lập của các tế bào bị xử lý hoặc không xử lý không có nhiều thay đổi. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ lên 2mM, các tế bào xâm lấn vào tế it đi rất rõ rệt so với đối chứng và tế bào trước khi xử lý. Điều này có nghĩa rằng, ở nồng độ cao hơn, vitamin đã làm giảm khả năng tăng sinh và di trú của tế bào.
Như những quả nghiên cứu trình bày trong mục 3.1 và 3.2 đã cho thấy vitamin C ức chế sự tăng sinh tế bào thông qua việc làm dừng chu kỳ phân chia tế bào ở pha G0/G1. Sự dừng chu kỳ tế bào G0/G1 đã được nhiều nghiên