a) Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng tạo sinh khối nấm trong môi trường dịch lỏng
Vật liệu nuôi cấy là hệ sợi nấm thu được từ các thí nghiệm trên. Thí nghiệm được bố trí với các công thức môi trường khác nhau kí hiệu l n lượt là:
M1: 20g/l Glucose + 0,1g/l MgSO4.7H2O + 0,1g/l KH2PO4 + 5g/l cao nấm men + 3g/l Pepton
M2: 20g/l Glucose + 0,1g/l MgSO4.7H2O + 0,1g/l KH2PO4 + 5g/l cao nấm men + 5g/l Pepton
M3: 20g/l Glucose + 0,1g/l MgSO4.7H2O + 0,1g/l KH2PO4 + 5g/l cao nấm men + 7g/l Pepton
Tiến hành nuôi l c ở tốc độ 150 v ng/phút, c ng đi u kiện nhiệt độ, độ ẩm. Sau 7 ngày nuôi l c dịch, quan sát đặc đi m hệ sợi nấm và thu thập số liệu.
b) Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khảnăng tạo sinh khối nấm
trong môi trường dịch lỏng
Vật liệu nuôi cấy là hệ sợi nấm thu được từ các thí nghiệm trên. Môi trường nuôi cấy là s dụng môi trường vừa nghiên cứu ở thí trên. Thí nghiệm được bố trí trong c ng đi u kiện nhiệt độ, độẩm, và tốc độ l c thay đổi từ 100 - 200 vòng/phút. Sau 7 ngày nuôi l c dịch, quan sát đặc đi m hệ sợi nấm và thu thập số liệu.
2.3.4. Phương phápnghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng bằng cơ chất tổng hợp phù
hợp với Cordyceps militaris bản địa.
a) Ảnh hưởng của nguồn C
Đ xác định được nguồn Cacbon tối ưu cho sự sinh trưởng và phát tri n của quả th , chúng tôi đã tiến hành th nghiệm trên 3 loại môi trường với hàm lượng Glucose thay đổi: 20g, 25g, 30g. Sau đó chọn ra môi trường tối ưu nhất.
Chuẩn bị 30 hộp cho mỗi loại môi trường với thành ph n các chất được phối trộn theo bảng 2.1 dưới đây.
Các lọ được bao k n, đem kh tr ng trong nồi hấp ở nhiệt độ 1000
C trong thời gian 3h. Sau khi kh tr ng môi trường được làm nguội tự nhiên rồi mới cấy giống.
S dụng phương thức cấy đa đi m giống sản xuất ở cả 3 loại môi trường. Quan sát so sánh và ghi lại kết quả v tốc độ sinh trưởng hệ sợi và thời gian hình thành quả th ở cả 2 loại môi trường đ xác định môi trường tối ưu.
Đánh giá đặc đi m hình thái quả th , tiến hành đo k ch thước quả th và số lượng quả th /hộp ở mỗi công thức.
Bảng 2.2. Công thức phối trộn3 loại môi trƣờng nuôi cấy sợi nấm C.militaris
Môi trƣờng C1 Môi trƣờng C2 Môi trƣờng C2
Gạo lứt khô: 18g Gạo lứt khô: 18g Gạo lứt khô: 18g
Glucose: 20 gam Glucose: 25 gam Glucose: 30 gam 20ml gồm nước dừa, nước
chiết malt.
20ml gồm nước dừa, nước chiết malt.
20ml gồm nước dừa, nước chiết malt.
Nhộng tươi: 10 g nghi n nhỏ Nhộng tươi: 10g nghi n nhỏ Nhộng tươi: 10g nghi n nhỏ 2ml hỗn hợp vi lượng gồm: KH2PO4 0,5g/l, cao nấm men 1g/l, Pepton 3g/l 2ml hỗn hợp vi lượng gồm: KH2PO4 0,5g/l, cao nấm men 1g/l, Pepton 3g/l 2ml hỗn hợp vi lượng gồm: KH2PO4 0,5g/l, cao nấm men 1g/l, Pepton 3g/l
b) Ảnh hưởng của nguồn nito
Trong th nghiệm này nhóm nghiên cứu s dụng hàm lượng Glucose đã được nghiên cứu ở trên. Đ xác định được nguồn Ni tơ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát tri n của quả th , chúng tôi đã tiến hành th nghiệm trên 3 loại môi trường với hàm lượng Nhộng tằm thay đổi: 5g, 10g, 15g.
Bảng 2.3. Công thức phối trộn 3 loại môi trƣờng nuôi cấy sợi nấm C.militaris
Môi trƣờng N1 Môi trƣờng N2 Môi trƣờng N3
Gạo lứt khô: 18g Gạo lứt khô: 18g Gạo lứt khô: 18g
Nhộng tươi: 5 g nghi n nhỏ Nhộng tươi: 10g nghi n nhỏ Nhộng tươi: 15g nghi n nhỏ 20ml gồm nước dừa,
nước chiết malt.
20ml gồm nước dừa, nước chiết malt.
20ml gồm nước dừa, nước chiết malt.
2ml hỗn hợp vi lượng gồm: KH2PO4 0,5g/l, cao nấm men 1g/l, Pepton 3g/l 2ml hỗn hợp vi lượng gồm: KH2PO4 0,5g/l, cao nấm men 1g/l, Pepton 3g/l 2ml hỗn hợp vi lượng gồm: KH2PO4 0,5g/l, cao nấm men 1g/l, Pepton 3g/l
Tiến hành th nghiệm:
Chuẩn bị 30 hộp cho mỗi loại môi trường với thành ph n các chất được phối trộn theo bảng trên đây.
Các lọ được bao k n, đem kh tr ng trong nồi hấp ở nhiệt độ 1000C trong thời gian 3h. Sau khi kh tr ng môi trường được làm nguội tự nhiên rồi mới cấy giống.
S dụng phương thức cấy đa đi m giống sản xuất ở cả 3 loại môi trường. Quan sát so sánh và ghi lại kết quả v tốc độ sinh trưởng hệ sợi và thời gian hình thành quả th ở cả 2 loại môi trường đ xác định môi trường tối ưu nhất.
Đánh giá đặc đi m hình thái quả th , tiến hành đo k ch thước quả th và số lượng quả th /hộp ở mỗi công thức.
c) Nghiên cứu ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng lên quá trình sinh trƣởng và phát triển của quả thể.
Chuẩn bị 90 lọ th nghiệm với c ng loại môi trường tối ưu đã được cấy giống, chia thành 3 lô (mỗi lô 30 lọ) tương ứng dụng đ th nghiệm với 3 đi m cường độ chiếu sáng được lựa chọn.
Chuẩn bị thiết bị chiếu sáng với hệ thống đ n có th đi u chỉnh đ có được 3 đi m cường độ chiếu sáng th nghiệm là 500Lux, 700Lux, 1000Lux.
Quan sát và ghi lại kết quả sự sinh trưởng và phát tri n của quả th
C.militarisnhằm xác định cường độ chiếu sáng th ch hợp cho quá trình sinh trưởng và phát tri n của quả th nấm.
Đánh giá đặc đi m hình thái quả th , tiến hành đo k ch thước quả th và số lượng quả th /hộp ở mỗi công thức.
d) Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian chiếu sáng đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của quả thể nấm
Bố tr 90 lọ th nghiệm c ng với loại môi trường tối ưu đã được cấy giống, chia thành 3 lô (mỗi lô 30 lọ) tương ứng d ng đ th nghiệm với 3 đi u kiện chiếu sáng được lựa chọn l n lượt là 7 giờ, 12 giờ, 24 giờ.
Quan sát và ghi lại kết quả sự sinh trưởng và phát tri n của quả th nấm
C.militaris nhằm xác định thời gian chiếu sáng tối ưu cho quá trình sinh trưởng và phát tri n của quả th .
Đánh giá đặc đi m hình thái quả th , tiến hành đo k ch thước quả th và số lượng quả th /hộp ở mỗi công thức.
e) Nghiên cứu ảnh hƣởng của độ ẩm lên quá trình sinh trƣởng và phát triển quả thể C.militaris
Bố tr 90 hộp th nghiệm c ng với loại môi trường tối ưu đã được cấy giống, chia thành 3 lô (mỗi lô 30 lọ) tương ứng dung đ th nghiệm với 3 đi m ẩm độ môi trường được lựa chọn l n lượt là 70%, 80%, 90%.
Quan sát và ghi lại kết quả sự sinh trưởng và phát tri n của quả th nấm
C.militaris nhằm xác định khoảng độ ẩm tối ưu cho quá trình sinh trưởng và phát tri n của quả th .
Đánh giá đặc đi m hình thái quả th , tiến hành đo k ch thước quả th và số lượng quả th /hộp ở mỗi công thức.
f) Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ lên quá trình sinh trƣởng và phát triển của quả thể C.militaris
Đi u kiện nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát tri n của ĐTHT trong tự nhiên là khoảng 22-230C. Vì vậy chúng tôi thiết kế th nghiệm trong môi trường có nhiệt độ nằm trong khoảng 20 -250C với 3 đi m nhiệt độ là 200
C, 220C, 240C. Quan sát và ghi lại sự sinh trưởng và phát tri n của quả th nấm C.militaris
nhằm tìm ra các khoảng nhiệt độ tối ưu trong nuôi trồng.
Đánh giá đặc đi m hình thái quả th , tiến hành đo k ch thước quả th và số lượng quả th /hộp ở mỗi công thức.
2.4. Nguyên liệu,hóa chất, thiết bị
Chuẩn bị trang thiết bị gồm: Bếp từ đơn Goldsun BA2101GT công xuất 1650W; Tủ cấy vô tr ng thổi đứng TTS – V1000; Nồi hấp kh tr ng 150 l t dạng đứng; Máy l c ngang China HY-2; Tủ sấy 125l của hang Biobase; máy phun sương và các thiết bị đo pH, thiết bị đo nhiệt độ, độ ẩm không kh , thiết bị đo cường độ ánh sáng.
Chuẩn bị dụng cụ gồm: dụng cụ th nghiệm bao gồm: đĩa peptri, ống fancol 50ml, chai thủy tinh 300ml, chai thủy tinh 500ml, đũa thủy tinh, ca đong 1 l t (2 l t), dao, nạo, giá đựng.
Chuẩn bị nguyên liệu gồm: glucose; gạo lứt; khoai tây; agar; bột nhộng khô; nhộng tươi nghi n nhỏ; nước dừa; nước chiết malt.
Chuẩn bị hóa chất gồm: MgSO4.7H2O; KH2PO4; Cao nấm men; pepton;
2.5. Phƣơng pháp thu thập và xử lý số liệu
Các thí nghiệm được lặp lại 3 l n và số liệu thu thập được x lý bằng ph n m m excel.
Phần 3.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả thu thập và định danh loài nấm Cordyceps militaris
3.1.1. Kết quả điều tra thu thập mẫu tại VQG Hoàng Liên - Lào Cai
VQG Hoàng Liên là khu vực khá đa dạng v thành ph n nấm ĐTHT. Vườn Quốc Gia Hoàng Liên có ph n lớn các đỉnh núi có độ cao trung bình từ 2000- 2500m, đặc biệt có đỉnh núi Panxipăng cao 3.143m so với mực nước bi n, nhiệt độ trung bình năm 15,20
C vào m a đông có băng tuyết nhiệt độ khoảng -30C phù hợp với sự sinh trưởng và phát tri n của nấm ĐTHT. Theo đánh giá của các nhà khoa học, VQG Hoàng Liên là một trong nh ng trung tâm đa dạng sinh vật vào bậc nhất của Việt Nam, là nơi c n sót lại của nhi u loài đặc h u, quý hiếm được ghi trong sách đỏ Việt Nam và sách đỏ thế giới.
Qua quá trình thu thập m u tại VQG Hoàng Liên - Lào Cai chúng tôi đã thu thập được 12 m u trong độ cao khoảng 2200m. Các m u được xác định là
Cordyceps militaris khi dựa vào đặc đi m hình thái bên ngoài được k hiệu như sau: CM1, CM2, CM5, CM7, CM13, CM14, CM18, CM24, CM28, CM29, CM32, CM34.
Phân t ch các d n liệu hình thái bằng cách xác định loại vật chủ, các đặc đi m hình thái, màu s c, k ch thước thân nấm. Chúng tôi nhận thấy các m u nấm có hình thái đặc trưng của loài Cordyceps militaris, phân nhánh đơn cấp hoặc đa cấp, quả th có hình trụ, tr n, màu cam đậm, ph n đ u quả th có hình tr nvà có bào t phủ quanh.Các m u này được tìm thấy trong thảm lá cây mục, trên lá cây hoặc trong thân cây gỗ mục dưới gốc cây d , k sinh trên ấu tr ng bọ cánh vảy. Cụ th như sau:
(1) Mẫu nấm CM1
Đặc điểm hình thái: Dựa vào đặc đi m bên ngoài có th nhận định đây là m u nấm Cordyceps militaris, có màu cam hơi vàng, quả th nhọn v ph a đ u, 1/3 ph n đ u nấm có bào t bao xung quanh. Màu s c của cây nấm chia rõ hai màu, ph n chân nấm màu tr ng hơi vàng 1/5 chi u dài nấm, đỉnh sinh trưởng của nấm
chính là ph n sinh sản chứa các múi dạng gai có màu cam hơi vàng dài bằng 1/4 chi u dài của nấm. Nấm ký sinh trên nhộng.
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris ký sinh trên nhộng.
Hình 3.1. Hình ảnh mẫu nấm CM1 thu ngoài tự nhiên
Phân bố: Được tìm thấy trên rừng tự nhiên, nơi có độ ẩm 87%, dưới lớp lá mục khô, dưới gốc cây tre, sinh cảnh rừng hỗn giao cây gỗ và cây tre.
(2) Mẫu nấm CM2
Đặc điểm hình thái: Dựa vào đặc đi m bên ngoài có th nhận định đây là m u nấm Cordyceps militaris, mọc từ ph n đ u của con nhộng. Quả th nấm hơi già, bào t phát tán g n hết. Màu s c của cây nấm chia rõ 3 màu, ph n chân nấm màu vàng dài bằng 1/5 chi u dài của nấm, ph n tiếp tiếp theo ph n chân nấm có màu cam hơi vàng dài bằng 1/3 chi u dài của nấm, và ph n còn lại có màu tr ng dài bằng ½ chi u dài nấm, ph n nau có bào t bao xung quanh.
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris ký sinh trên nhộng sâu còn một lớp kén mỏng của sâu gi .
Hình 3.2. Hình ảnh mẫu nấm CM2 thu ngoài tự nhiên
Phân bố: Nấm được tìm thấy trên thân cây gỗ mục ven đường mòn ph n nhộng nằm trong thân cây chỉ nhìn thấy quả th nhô lên khỏi mặt đất, nơi có độ ẩm 90%, có lớp rêu bao xung quanh, sinh cảnh rừng hỗn giao cây gỗ và cây bụi có độ tàn che 3-4 m.
(3) Mẫu nấm CM5
Đặc điểm hình thái: Dựa vào đặc đi m bên ngoài có th nhận định đây là m u nấm Cordyceps militaris, nấm có màu da cam hơi vàng, quả th nấm có màu cam đậm, đ u quả th hơi nhọn d n, bào t nấm bao xung quanh 1/3 quả th , nấm đang ởgiai đoạn trưởng thành, bảo t b t đ u phát tán.
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris ký sinh trên nhộng còn nguyên kén và lớp lông của con sâu d .
Phân bố: Nấm được tìm thấy trong rừng tự nhiên, vị trí tìm thấy là dưới gốc cây d bị khô mục, nơi có độ ẩm thấp khoảng 90%, sinh cảnh rừng hỗn giao cây gỗ thấp và thảm cây bụi rêu xanh, ở độ cao 2200m.
Hình 3.3. Hình ảnh mẫu nấm CM5 thu ngoài tự nhiên (4) Mẫu nấm CM7
Đặc điểm hình thái: Dựa vào đặc đi m bên ngoài có th nhận định đây là m u nấm Cordyceps militaris này có màu vàng cam hơi nhạt, thân hơi dẹt, 1/3 đ u quả th nấm có bào t xung quanh, đ u quả th nhọn, 2/3 quả th còn lại có màu nhạt hơn, quả th nhọn d n v ph a đ u nấm. Nấm đang ở giai đoạn già, bào t đã phát tán g n hết.
Hình 3.4. Hình ảnh mẫu nấm CM7 thu ngoài tự nhiên
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris này ký chủ trên con nhộng của sâu tre.
Phân bố: Được tìm thấy dưới gốc tre trong rừng tự nhiên, xung quanh là lớp lá khô, rêu xanh và thảm thực vật cây bụi thấp, độẩm 83%, ởđộ cao 2200m.
(5) Mẫu nấm CM13
Hình 3.5. Hình ảnh mẫu nấm CM13 thu ngoài tự nhiên
Đặc điểm hình thái: Dựa vào đặc đi m bên ngoài có th nhận định đây là m u nấm Cordyceps militaris, nấm có hình thái là hình trụ thuôn, màu s c của nấm có màu da cam hơi vàng, đ u quả th nấm hơi nhọn, 1/2 quả th nấm có các bào t bao xung quanh nấm, 1/2 quả th còn lại không có bào t bao xung quanh, có màu nhạt hơn. Giai đoạn này bào t nấm chưa phát tán. Vị trí quả th mọc là đ u của con nhộng.
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris ký sinh trên con nhộng của sâu của loài cánh vẩy.
Phân bố: Nấm được tìm thấy trong rừng tự nhiên, vị trí tìm thấy là dưới lớp đất, có rêu, ởđộ cao 2000m, độẩm 90%.
(6) Mẫu nấm CM14
Đặc điểm hình thái: Dựa vào đặc đi m bên ngoài có th nhận định đây là m u nấm Cordyceps militaris, nấm có màu da cam hơi vàng, quả th nấm hình chuỳ, 1/4 chân nấm có màu tr ng hơi vàng, đ u quả th hơi nhọn d n, bào t nấm bao xung quanh 2/3 quả th , nấm đang ở giai đoạn b t đ u trưởng thành, bảo t b t đ u phát tán.
Hình 3.6. Hình ảnh mẫu nấm CM14 thu ngoài tự nhiên
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris ký sinh trên nhộng còn nguyên kén và lớp lông của con sâu d .
Phân bố: Nấm được tìm thấy trong rừng tự nhiên, vị trí tìm thấy là dưới gốc cây d bị khô mục, nơi có độ ẩm thấp khoảng 90%, sinh cảnh rừng hỗn giao cây gỗ thấp và thảm cây bụi rêu xanh, ở độ cao 2200m.
(7) Mẫu nấm CM18
Đặc điểm giải phẫu: Dựa vào đặc đi m hình thái bên ngoài có th nhận định là m u nấm Cordyceps militaris có màu vàng cam, hình trụ thuôn. Chân nấm màu tr ng hơi vàng, bằng 1/3 cây nấm, đ u nấm chứa các bào t màu vàng da cam. Ph n