Phân lập là công việc khó vì không nh ng c n thực hiện thao tác nhanh, khéo léo, cẩn thận mà c n phải tìm công thức kh tr ng ph hợp đ có th tiêu diệt
hoàn toàn các vi sinh vật (nấm mốc, vi khuẩn), đồng thời v n phải gi được sức sống cho m u nấm ban đ u. Vấn đ chọn loại hóa chất, nồng độ s dụng và thời gian kh tr ng là một việc rất khó, c n có nhi u nghiên cứu đ tìm ra nồng độ tốt nhất cho từng loại m u của từng loại nấm, từng loại vật liệu. Các chất kh tr ng thông dụng là: H202, HgCl2, nước bromine, sodium….
Trong th nghiệm này, chúng tôi s dụng dung dịch cồn 70% trong 1 phút và kháng sinh cefotaxime 400mg/l trong thời gian từ 2- 4 phút đ kh tr ng m u. Hiệu quả kh tr ng được đánh giá thông quá tỷ lệ m u sạch, tỷ lệ m u sạch tái sinh, đường k nh khuẩn lạc sau 5,7,10 ngày, đặc đi m hệ sợi. Kết quả phân lập giống gốc cho 8 m u được định danh là Codyceps militaristrình bày trong bảng dưới đây:
Bảng 3.9. Kết quả phân lập mẫu nấm Codyceps militaristhu ngoài tự nhiên
TT Mẫu Tỉ lệ mẫu sạch (%) Tỉ lệ mẫu sạch tái sinh ( %) Số ngày bắt đầu xuất hiện hệ sợi Đƣờng kính khuẩn lạc (mm) Đặc điểm hệ sợi
5 ngày 7 ngày 10 ngày
1 CM1 57,14 57,14 3 7,00 ± 0,10 13,20 ± 0,10 22,40 ± 0,30 +++ 2 CM2 33,33 33,33 3 8,10 ± 0,07 14,40 ± 0,13 24,80 ± 0,07 ++ 3 CM7 50,00 50,00 3 7,27 ± 0,18 13,47± 0,16 23,30 ± 0,13 ++ 4 CM13 50,00 50,00 3 4,15 ± 0,10 7,60 ± 0,05 17,78 ± 0,09 +++ 5 CM18 86,67 66,67 3 6,87 ± 0,12 10,19 ± 0,15 20,36 ± 0,21 +++ 6 CM29 60,00 50,00 3 6,96 ± 0,09 12,10 ± 0,08 22,72 ± 0,06 +++ 7 CM32 73,33 73,33 3 5,61 ± 0,10 12,85 ± 0,08 23,15 ± 0,10 +++ 8 CM34 54,55 54,55 3 5,53 ± 0,08 12,83 ± 0,07 23,25 ± 0,15 +++ Ghi chú:
++: ệ sợi nấm bông, ngắn, màu trắng. Nấm sinh trưởng nhanh trên môi trường nhân tạo.
+++: ệ sợi nấm bông, sợi nấm dài, mọc thẳng. Nấm sinh trưởng nhanh trên môi trường nhân tạo.
Căn cứ vào bảng 3.9 chúng tôi nhận thấy rằng, trong tổng số 08 m u
Codyceps militaris thu thập ngoài tự nhiên, chúng tôi đã phân lập giống gốc thành công cho cả 08 m u, trong đó tỉ lệ phân lập cho m u sạch cao nhất đạt 73,33% (CM32) và tỉ lệ phân lập m u sạch thấp nhất đạt 33,33% (CM2), tốc độ ăn lan sợi nấm trên môi trường cơ bản PGA của các chủng nấm khác nhau là khác nhau.Đường kính khuẩn lạc lớn nhất đạt 24,80 ± 0,07 (mm) ở m u CM2 và đường kính khuẩn lạc nhỏ nhất đạt 17,78 ± 0,09 (mm) ở m u CM13 sau 10 ngày phân lập. Ở m u CM2 quan sát thấy hệ sợi nấm bông, ng n, màu tr ng trong khi ở m u CM13 chúng tôi lại thấy hệ sợi nấm bông, d y, dài, mọc thẳng sau 10 ngày nuôi cấy. Cả hai m u này đ u cho thấy chúng sinh trưởng tốt trên môi trường nhân tạo.
Hình 3.30. Mẫu CM2 và CM13 sau 10 ngày phân lập
Các m u: CM1, CM18, CM29, CM32, CM34 đ u có chung đặc đi m hệ sợi là sợi là hệ sợi nấm dài, bông tr n đ u, sinh trưởng nhanh trên môi trường nhân tạo.Có th thấy tốc độ phát tri n của từng m u khác nhau là khác nhau, khả năng thích nghi với môi trường nhân tạo của mỗi m u khác nhau là khác nhau khiến đường kính khuẩn lạc của các m u thay đổi theo thời gian nuôi cấy.
Hình 3.31. Hình ảnh các mẫu nấm ngoài tự nhiên sau 10 ngày phân lập 3.3. Kỹ thuật nhân giống cấp 1 và cấp 2 nấm Cordyceps militaris
3.3.1. Nhân giống cấp 1 trên môi trường thạch
a) Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng sinh trưởng của hệ sợi
Đ tiến hành nghiên cứu đặc đi m của thành ph n môi trường đến khả năng sinh trưởng của hệ sợi chúng tôi tiến hành cấy chấm đi m 8 m u trên 3 môi trường khác nhau: PDA, Hansen, Czapek-Dox, đi u chỉnh pH bằng 7, nuôi cấy ở 25oC, độ ẩm 80%, không chiếu sáng. Theo dõi sự sinh trưởng của hệ sợi thông qua việc đo khuẩn lạc các m u sau 7, 10, 15 ngày. Kết quả nghiên cứu cho thấy trên 3 môi trường PDA, Hansen, Czapek-Dox d ng đ nuôi cấy nấm thì nấm có sựsinh trưởng và khác nhau trên mỗi loại môi trường.
Sự sinh trưởng và phát tri n của nấm Cordyceps militaris trên các môi trường khác nhau là khác nhau. Quan sát 8 m u cho thấy khi nuôi cấy trên môi trường Hansen các m u đ u phát tri n rất yếu. Sau 5 ngày nuôi cấy trên 20 đĩa thạch đối với mỗi loại môi trường cho thấy tỉ lệ mọc trên môi trường Hansen ở các m u trung bình khoảng 30%. Sau 15 ngày nuôi cấy quan sát thấy trên b mặt môi trường các m u khuẩn lạc h u như không phát tri n thêm. Như vậy nhận thấy môi trường môi trường Hansen không thích hợp cho nấm Cordyceps militaris.
Hình 3.32. Hình ảnh các mẫu nấm sau 15 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng Hansen
Tiếp tục quan sát 8 m u khi nuôi cấy trên môi trường Czapek-Dox cho thấy các m u đ u phát tri n rất yếu. Sau 5 ngày nuôi cấy trên 20 đĩa thạch cho thấy tỉ lệ mọc trên môi trường Czapek-Dox ở các m u chiếm khoảng 10%. Sau 15 ngày nuôi cấy quan sát thấy trên cả hai môi trường các m u khuẩn lạc h u như không phát tri n thêm. Như vậy nhận thấy môi trường Czapek-Dox không thích hợp cho nấm
Hình 3.33. Hình ảnh các mẫu nấm sau 15 ngày nuôi cấy trên môi trƣờngCzapek-Dox
So sánh với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Hậu (Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam, 2014) cho thấy: Sau 5 ngày nuôi cấy trên 20 đĩa thạch đối với mỗi loại môi trường thì ở môi trường Czapek-Dox mới có 2 đĩa thạch nấm
Cordyceps militaris mọc, môi trường Hansen có 5 đĩa mọc nhưng cả 7 đĩa đ u chỉ xuất hiện chấm tr ng nhỏ, ghi nhận sau 10, 15, 20 ngày nuôi cấy, khuẩn lạc h u như không phát tri n thêm.
Kết quả nghiên cứu của đ tài thu được có nh ng đi m tương đồng như: khi nuôi cấy trên môi trường Czapek-Dox và môi trường Hansen tỷ lệ mọc trên hai loại
môi trường đ u thấp, các m u khi nuôi cấy trong thời gian tiếp theo đ u không thấy sinh trưởng. Như vậy chúng tôi nhận thấy rằng môi trường Czapek-Dox và môi trường Hansen không phù hợp cho sự phát tri n của nấm Cordyceps militaris.
Trên môi trường còn lại PGA cho thấy hệ sợi nấm các m u đ u phát tri n mạnh. Đường kính khuẩn lạc của mỗi m u sau 15 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.10. Đƣờng kính sinh trƣởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trên môi trƣờng cơ bản PGA
STT Mẫu Đƣờng kính khuẩn lạc (mm) Đặc điểm
hệ sợi
7 ngày 10 ngày 15 ngày
1 CM1 26,86 ± 0,11 31,83 ± 0,67 44,10 ± 0,09 +++ 2 CM2 24,40 ± 0,13 31,60 ± 0,13 41,90 ± 0,07 ++ 3 CM7 26,70 ± 0,04 37,75 ± 0,11 49,00 ± 0,13 +++ 4 CM13 25,79 ± 0,20 32,50 ± 0,18 44,92 ± 0,14 +++ 5 CM18 19,45 ± 0,15 32,30 ± 0,04 42,40 ± 0,02 +++ 6 CM29 23,76 ± 0,11 30,16 ± 0,14 40,34 ± 0,09 ++ 7 CM32 20,43 ± 0,02 30,15 ± 0,09 40,28 ± 0,07 ++ 8 CM34 25,35 ± 0,07 34,20 ± 0,07 44,35 ± 0,05 +++ Ghi chú: ++: Hệ sợi nấm bông, ngắn, màu trắng +++: Hệ sợi nấm bông, sợi nấm dài, mọc thẳng
Căn cứ vào bảng 3.2 cho thấy các m u các m u nấm Cordyceps militarisđ u sinh trưởng nhanh trên môi trường PGA. Tốc độsinh trưởng của hệ sợi đa số đ u > 40 (mm) sau 15 ngày nuôi cấy.
Quan sát sau 7 ngày nuôi cấy nhận thấy: tốc độ sinh trưởng của m u CM1 đạt đường kính khuẩn lạc lớn nhất (26,86 ± 0,11) (mm). Nhưng sau 15 ngày nuôi cấy đường kính khuẩn lạc lớn nhất lại là m u CM7 đạt 49,00 ± 0,13 (mm).
Hình 3.34. Hình ảnh mẫu CM1 sau 7 ngày nuôi cấy và mẫu CM7 sau 15 ngày nuôi cấy
Nhìn chung tốc độ sinh trưởng của các m u tương đối ổn định.Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi đa số đ u > 40(mm) sau 15 ngày nuôi cấy. Đi u này chứng tỏ rằng môi trường PGA là môi trường thích hợp nhất cho sựsinh trưởng và phát tri n của hệ sợi nấm Cordyceps militaris.
Hình 3.36. Hình ảnh các mẫu nấm sau 15 ngày nhân giống trên môi trường PGA
b) Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độđến khảnăng sinh trưởng hệ sợi
Đ xác định sự ảnh hưởng của nhiệt độ không kh đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống, chúng tôi tiến hành nuôi cấy các m u nấm trong các thang nhiệt độ không khí khác nhau (20oC, 25oC, 30oC). Hệ sợi nấm được nuôi cấy trên môi trường PGA ởđộ ẩm 80%, pH = 7, không chiếu sáng. Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm ở các đi u kiện nhiệt độ không khí khác nhau được th hiện trong bảng 3.11 dưới đây:
Bảng 3.11. Đƣờng kính sinh trƣởng của các hệ sợ nấm Cordyceps militarisở các điều kiện nhiệt độ khác nhau
STT Mẫu Nhiệt độ
(oC)
Đƣờng kính khuẩn lạc (mm) Đặc điểm
hệ sợi
7 ngày 10 ngày 15 ngày
1 CM1
20 15,13 ± 0,67 25,09 ±1,13 35,17 ±0,11 +++ 25 26,80 ± 0,04 31,72 ±0,07 44,10 ±0,09 +++ 30 10,30 ± 0,07 20,00 ±0,67 29,53 ±1,13 +++
2 CM2 20 13,13 ± 0,04 21,07 ±0,67 31,10 ±0,07 +++ 25 25,62 ± 0,07 35,65 ±0,05 47,33 ±0,04 +++ 30 9,87 ± 0,09 20,89 ±0,67 31,00 ±0,04 +++ 3 CM7 20 14,05 ± 0,09 24,80 ±0,67 34,64 ±1,11 ++ 25 26,70 ± 0,07 37,77 ±1,14 49,57 ±0,04 ++ 30 10,06 ± 0,78 20,67 ±0,89 30,00 ±0,07 ++ 4 CM13 20 12,54 ± 0,07 22,23 ±0,69 32,00 ±0,20 +++ 25 25,94 ± 0,24 32,50 ±1,12 44,85 ±0,07 +++ 30 8,67 ± 0,04 18,79 ±0,89 29,00 ±0,10 +++ 5 CM18 20 7,90 ± 0,07 17,89 ±0,96 27,10 ±0,90 +++ 25 20,80 ± 0,05 30,3 ± 0,13 40,90 ±0,07 +++ 30 6,00 ± 0,07 16,89 ±0,11 26,70 ±0,18 +++ 6 CM29 20 7,00 ± 0,10 19,07 ±0,13 29,80 ±0,90 +++ 25 19,36 ± 0,04 30,05 ±0,15 40,30 ±0,10 +++ 30 6,70 ± 0,06 18,57 ±0,07 29,00 ±0,10 +++ 7 CM32 20 8,80 ± 0,20 19,07 ±0,17 30,00 ±0,20 +++ 25 20,42 ± 0,07 30,33 ±0,11 40,27 ±0,09 +++ 30 6,05 ± 1,13 17,89 ±0,04 27,90 ±0,10 +++ 8 CM34 20 14,00 ± 0,10 24,67 ±1,13 34,90 ±0,19 +++ 25 25,35 ± 0,15 34,33 ±0,11 44,36 ±0,09 +++ 30 10,03 ± 0,04 21,11 ±0,09 32,89 ±0,13 +++ Ghi chú: ++: Hệ sợi nấm bông, ngắn, màu trắng +++: Hệ sợi nấm bông, sợi nấm dài, mọc thẳng
Căn cứ vào bảng 3.11 chúng tôi nhận thấy rằng: trong tổng số 8 m u nghiên cứu đ u cho thấy đặc đi m chung là hệ sợi nấm sinh trưởng và phát tri n tốt nhất ở 25oC.
Xét ảnh hưởng của nhiệt độđến sựsinh trưởng và phát tri n của m u nấm CM1. Dựa vào kết quả bảng 3.2 chúng tôi nhận thấy rằng: sựsinh trưởng của hệ sợi nấm ở các thang nhiệt độ khác nhau rõ rệt. Sau 7 ngày, 10 ngày và 15 ngày nuôi cấy nấm sinh trưởng tốt nhất ở 25oC. Đường kính khuẩn lạc đạt 47,33 ± 0,04 (mm) sau 15 ngày nuôi cấy. Nhận thấy nấm sinh trưởng yếu nhất ở nhiệt độ 30oC, sau 10 ngày mới đạt 20,89 ± 0,67(mm). Cho tới 15 ngày nuôi cấy hệ sợi nấm mới đạt 29,53 ± 1,13 (mm). Cụ th đường k nh sinh trưởng của hệ sợi giảm d n theo thứ tựnhư sau: 25oC > 20oC > 30oC. Như vậy, hệ sợi nấm m u CM1 sinh trưởng và phát tri n tốt nhất ở 25oC.
Hình 3.37. Hình ảnh mẫu nấm CM1
(A. 20oC - 10 ngày B. 30oC - 10 ngày C. 25oC - 10 ngày)
Xét ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát tri n của m u nấm CM2.
Dựa vào kết quả bảng 3.2 chúng tôi nhận thấy rằng: sựsinh trưởng của hệ sợi nấm ở các thang nhiệt độ khác nhau rõ rệt. Sau 7 ngày, 10 ngày và 15 ngày nuôi cấy sợi nấm sinh trưởng tốt nhất ở 25oC. Đường kính khuẩn lạc đạt 44,10 ± 0,09 (mm) sau 15 ngày nuôi cấy. Nhận thấy sợi nấm sinh trưởng yếu nhất ở nhiệt độ 30oC, sau 10 ngày mới đạt 20,00 ± 0,67 (mm). Cho tới 15 ngày nuôi cấy hệ sợi nấm mới đạt 31,00 ± 0,04 (mm). Cụ th đường k nh sinh trưởng của hệ sợi giảm d n theo thứ tự như sau: 25oC > 20oC > 30oC. Như vậy, hệ sợi nấm m u CM2 sinh trưởng và phát tri n tốt nhất ở 25oC.
Hình 3.38. Hình ảnh mẫu nấm CM2
(A. 20oC - 15 ngày B. 25oC - 15 ngày C. 30oC - 15 ngày)
Xét ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát tri n của m u nấm CM7.
Dựa vào kết quả bảng 3.2 chúng tôi nhận thấy rằng: sựsinh trưởng của hệ sợi nấm ở các thang nhiệt độ khác nhau rõ rệt. Sau 7 ngày, 10 ngày và 15 ngày nuôi cấy nấm sinh trưởng tốt nhất ở 25oC. Đường kính khuẩn lạc đạt 49,57 ± 0,04 (mm) sau 15 ngày nuôi cấy. Nhận thấy nấm sinh trưởng yếu nhất ở nhiệt độ 30oC, sau 10 ngày mới đạt 20,67 ± 0,89 (mm). Cho tới 15 ngày nuôi cấy hệ sợi nấm mới đạt 30,00 ± 0,07 (mm). Như vậy, hệ sợi nấm m u CM7 sinh trưởng và phát tri n tốt nhất ở 25oC.
Hình 3.39. Hình ảnh mẫu nấm CM7
(A. 20oC - 15 ngày B. 25oC - 15 ngày C. 30oC - 15 ngày)
Xét ảnh hưởng của nhiệt độđến sựsinh trưởng và phát tri n của các m u còn lại. Dựa theo kết quả bảng 3.2. chúng tôi nhận thấy rằng: sự sinh trưởng của hệ sợi nấm ở các thang nhiệt độ khác nhau rõ rệt. Sau 7 ngày, 10 ngày và 15 ngày nuôi cấy nấm sinh trưởng tốt nhất ở 25oC và yếu nhất ở 30oC. Cụ th đường kính sinh trưởng của hệ sợi giảm d n theo thứ tự như sau: 25oC > 20oC > 30oC. Như vậy, hệ sợi nấm sinh trưởng và phát tri n tốt nhất ở 25oC.
Vì vậy, chúng tôi nhận thấy nhiệt độ phù hợp nhất cho sựsinh trưởng và phát tri n hệ sợi nấm Cordyceps militaris là ở 25oC
Hình 3.40. Hình ảnh các mẫu nấm sau 15 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 25oC
3.3.2. Nhân giống cấp 2 trên môi trường lỏng
a) Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng tạo sinh khối nấm trong môi trường dịch lỏng
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành cấy các giống Cordyceps militaris
trong ba môi trường khác nhau. Sau đó nuôi l c ở tốc độ 150 v ng/phút, c ng đi u kiện nhiệt độ, độ ẩm. Sau 7 ngày l c dịch quan sát đặc đi m khuẩn lạc và lượng sinh khối hệ sợi. Số liệu thu thập được trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.12. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng đến khả năng tạo sinh khối nấm trong môi trƣờng dịch thể
STT Mẫu Môi
trƣờng
Sinh khối
dịch (g/l) Đặc điểm hệ sợi
1 CM1
M1 8,20± 0,09 Hệ sợi phát tri n chậm, đường kính khuẩn lạc nhỏ khoảng 1,6mm.
M2 12,83 ± 0,04 Hệ sợi phát tri n đồng đ u tạo thành các khuẩn lạc có đường kính khoảng 4,1mm.
M3 9,60± 0,60 Hệ sợi phát tri n chậm, đường kính khuẩn lạc nhỏ khoảng 2mm.
2 CM2
M1 7,20± 0,10 Hệ sợi phát tri n chậm, đường kính khuẩn lạc nhỏ khoảng 1,2mm.
M2 12,33 ± 0,04 Hệ sợi phát tri n đồng đ u, kích thức khuẩn lạc sau 7 ngày nuôi cấy 4,0mm
M3 9,15 ± 0,07 Hệ sợi phát tri n chậm, đường kính khuẩn lạc nhỏ khoảng 1,6mm.
3 CM7
M1 7,60 ± 0,07 Hệ sợi phát tri n chậm, đường kính khuẩn lạc nhỏ khoảng 1,3mm.
M2 12,47 ± 0,09 Hệ sợi phát tri n đồng đ u, khuẩn lạc to, tròn, kích thước khuẩn lạc đạt 3,5mm sau 7 ngày l c dịch M3 9,30 ± 0,08 Hệ sợi phát tri n chậm, đường kính khuẩn lạc nhỏ
khoảng 1,6mm.
4 CM13
M1 7,00 ± 0,04 Hệ sợi phát tri n chậm, đường kính khuẩn lạc nhỏ M2 12,43 ± 0,04 K ch thước khuẩn lạc to, tr n, đường kính khuẩn lạc
trung bình sau 7 ngày l c dịch là 3,0mm
M3 9,15 ± 0,12 Hệ sợi phát tri n chậm, đường kính khuẩn lạc nhỏ
5 CM18
M1 8,35 ± 0,05 Hệ sợi phát tri n chậm, đường kính khuẩn lạc nhỏ khoảng 0,5mm
M2 12,60 ± 0,07 Hệ sợi phát tri n đồng đ u, k ch thước khuẩn lạc đạt 2,7mm sau 7 ngày l c dịch
M3 9,80 ± 0,20 Hệ sợi phát tri n chậm, đường kính khuẩn lạc nhỏ khoảng 0,8mm.
6 CM29
M1 6,15 ± 0,20 Hệ sợi phát tri n chậm, đường kính khuẩn lạc nhỏ M2 11,63 ± 0,04 Hệ sợi phát tri n đồng đ u, k ch thước khuẩn lạc nhỏ
sau 7 ngày l c dịch đạt 1,4mm
M3 6,35 ± 0,05 Hệ sợi phát tri n chậm, đường kính khuẩn lạc nhỏ