(1) Phương pháp thu thập nấm Cordyceps militaris ngoài tự nhiên
a) Chuẩn bị:
- Thu thập số liệu chung v vị tr địa l , đi u kiện tự nhiên, kinh tế - xã hội các xã nằm trong phạm vi khu vực nghiên cứu, các tài liệu, báo cáo, nghiên cứu khoa học... v các khu vực các vùng mi n và các Vườn Quốc Gia, các tài liệu v nấm Đông tr ng hạ thảo và nh ng vấn đ có liên quan đên lĩnh vực nghiên cứu.
- Chuẩn bị bản đồ, máy ảnh, máy định vị và các dụng cụ phục vụ cho đi u tra và thu hái nấm.
- Thời gian ủ tối
- Quan sát đặc đi m hệ sợi sau ủ tối
Quả th nấm C.militaris ngoài tự nhiên
Hệ sợi C.militaris sau khi phân lập
Hệ sợi C.militaris sau khi nhân giống cấp 1
Sinh khối hệ sợi sau nhân giống cấp 2
Phâ n lập
- Đo đường kính khuẩn lạc - Quan sát đặc đi m hệ sợi
Nhân giống cấp 1
- Đo đường kính khuẩn lạc
- Quan sát đặc đi m hệ
Nhân giống cấp 2
- Đo đường kính khuẩn lạc
- Khối lượng sinh khối hệ sợi - SLKL/10ml dịch - Quan sát đặc đi m hệ sợi Hộp cơ chất tổng hợp đã cấy giống và ủ tối Cấy giống, ủ Quả th nấm C.militaris Nuôi trồng tạo quả th - Thời gian ra quả th - Khối lượng quả th - K ch thước quả th - Màu s c quả th
- N m và phân loại các trạng thái, loại hình rừng hiện có trong khu vực nghiên cứu.
- Xác định hệ thống tuyến, địa đi m đi u tra, trên cơ sở các tài liệu v đặc đi m sinh vật học, sinh thái học của nấm như: m a vụ sinh trưởng; vị trí nấm thường mọc, độcao, độẩm, độ tàn che…
b) Điều tra ngoại nghiệp
Đi u tra được tiến hành vào các tháng m a mưa (từ tháng 5 đến tháng 8). Khảo sát thu m u được thực hiện trên các tuyến đi u tra ngoài thực địa qua các dạng địa hình, các dạng thực bì trong khu vực nghiên cứu. Các tuyến đi u tra được thiết kếđi men theo rìa suối, dọc theo khe, suối cạn và đường mòn hoặc dông núi từ dưới thấp lên cao và ngược lại. Trên tuyến đi u tra cứ 20 -30 (m) tiến hành 1 đi m đi u tra, hoặc phát hiện địa đi m có đi u kiện thuận lợi cho nấm đông tr ng hạthảo phát tri n thì tiến hành khoanh v ng và đi u tra tỷ mỷ. Tại các đi m đi u tra tiến hành đi u tra kỹ ph a dưới thân cây đổ, dưới lớp lá mục và các khoảng đất trống trong rừng. Phát hiện được m u nấm tiến hành đào thu m u nấm k cả côn trùng bị ký sinh còn d nh; đánh số hiệu, chụp ảnh, đo đếm k ch thước mô tả đặc đi m hình thái của nấm, côn trùng bị k sinh và các đặc đi m của địa đi m thu m u…
Các khu vực thu thập có sự khác biệt nhau v độcao. Độ cao là yếu tố quyết định đến ki u khí hậu và thực vật. Theo các tài liệu của các nhà khoa học trên thế giới cho thấy nấm ĐTHT thường xuất hiện ở độ cao trên 1000m. Đây là độ cao lí tưởng cho nấm sinh trưởng và phát tri n. Vườn Quốc Gia Hoàng Liên nằm ở núi cao, có ki u khí hậu và thảm thực vật khác nhi u so với các khu vực khác. Với độ cao trung bình 1.500m- 2500m so với mặt nước bi n, vì vậy thành ph n loài nấm ĐTHT rất khác so với các VQG và Khu Bảo tồn thiên nhiên khác của Việt Nam.
M u nấm sau khi thu hái, được bọc trong lá cây hoặc giấy khô, m m, tránh không làm tổn thương đến nấm và bỏ vào ống fancol bảo quản trong th ng đựng đá đưa v phòng thí nghiệm đ giám định, nghiên cứu các đặc đi m giải ph u, bào t và phân lập thu n khiết nấm.
(2) Phương pháp định danh loài nấm Cordyceps militaris bằng phân tử.
a) Phương pháp tách DNA tổng số
1. Nghi n 0,2g m u bằng cối chày sứtrong nitơ lỏng cho đến khi tạo ra bột thật mịn, sau đó chuy n ngay vào ống eppendorf 2ml, gi trong đá.
2. Bổ sung 800 l đệm chiết, l c đ u và ủở 65oC trong 1 giờ (cứ15 phút đảo đ u 1 l n).
3. Gi m u ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 phút.
4. Bổ sung 800 l Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) vào m u, l c đ u và gi ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 phút.
5. Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong thời gian 15 phút ở 4oC. 6. Dùng pipet hút chuy n dịch nổi sang ống eppendorf 1,5ml.
7. Bổ sung một th t ch tương đương Isopropanol tuyệt đối (lạnh) và đảo nhẹ, gi m u trong đá 30 phút.
8. Ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 15 phút ở 4oC.
9. Loại dịch nổi, r a DNA bằng cách thêm 500 l cồn 70%, ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 4 phút ở 4oC sau đó nhẹ nhàng loại bỏ ethanol
10. Làm khô DNA bằng quạt gió, máy hút chân không 11. Hoà tan trong 100 l H2O kh ion.
12. Sau khi DNA được hoà tan hoàn toàn thì bổ sung 3 l RNase (10mg/ml). Gi sản phẩm ở 37oC trong thời gian 1 giờ.
13. Điện di ki m tra DNA tổng số trên gel agarose 0,8%. b) Phương pháp PCR s dụng cặp mồi đặc hiệu
Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi ITS2 và ITS5 có trình tự:
ITS2 (5′- GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′) ITS5 (5'- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG -3') Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước deion kh trùng 6 2 Maste mix 10 3 Template (100ng/µl) 2 4 Mồi F 10 pmol 1 5 Mồi R 10 pmol 1 Tổng 20
c) Phương pháp giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự:
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2,0% và tinh sạch bằng QiAquick gel extraction kit (Qiagen, Đức). Sản phẩm này được s dụng làm khuôn cho phản ứng giải trình tự trực tiếp hai chi u (mồi xuôi và mồi ngược).S dụng BigDye terminator cycler v3.1 và đọc kết quả trên hệ thống ABI 3500 XL (Applied Biosystems, Mỹ). Trình tự nucleotide của các chủng nấm được so sánh với các trình tự đã có trên Genbank, s dụng ph n m m BLAST trong NCBI (website http:www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Trình tự DNA sau khi đọc được hiệu chỉnh bằng m t với sự trợ giúp của ph n m m ChromasPro1.7.6 đ loại bỏ các vùng tín hiệu nhiễu. Các trình tựphân t ch được s p xếp thẳng hàng bằng ph n m m Bioedit v7.0.5.2, Clustal W, geneDoc Các vùng không có khảnăng s p xếp bị loại bỏtrước khi phân tích. Thành phần Chiều F Chiều R BigDye™ Terminator 3.1 Ready Reaction Mi 4 µL 4 µL
Forward primer (3,2 pmol) 1µL -
Reverse primer (3,2 pmol) - 1µL
Nước 4 µL 4 µL
Sản phẩm PCR 1µL 1µL
Tổng cộng 10 µL 10 µL
Đ xây dựng cây tiến hóa, xác định quan hệ di truy n bằng phương pháp Maximum Likehood, d liệu DNA được chuy n vào ph n m m Mega 6.0.6 (Tamura et al., 2013) và chúng được thực hiện với 1.000 l n lặp lại đ xác định giá trịủng hộ (bootstrap).