Nội dung nghiên cứu

- Thu thập và định danh loài nấm Cordyceps militaris thu thập được; - Nghiên cứu kỹ thuật phân lập giống gốc nấm Cordyceps militaris;

- Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống cấp 1 và nhân giống cấp 2 nấm

Cordyceps militaris.

- Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng bằng cơ chất tổng hợp ph hợp với

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

Sơ đồ tổng quát các phương pháp thực hiện cho các nội dung nghiên cứu như sau:

2.3.1. Phương pháp thu thập và định danh loài nấmCordyceps militaris.

(1) Phương pháp thu thập nấm Cordyceps militaris ngoài tự nhiên

a) Chuẩn bị:

- Thu thập số liệu chung v vị tr địa l , đi u kiện tự nhiên, kinh tế - xã hội các xã nằm trong phạm vi khu vực nghiên cứu, các tài liệu, báo cáo, nghiên cứu khoa học... v các khu vực các vùng mi n và các Vườn Quốc Gia, các tài liệu v nấm Đông tr ng hạ thảo và nh ng vấn đ có liên quan đên lĩnh vực nghiên cứu.

- Chuẩn bị bản đồ, máy ảnh, máy định vị và các dụng cụ phục vụ cho đi u tra và thu hái nấm.

- Thời gian ủ tối

- Quan sát đặc đi m hệ sợi sau ủ tối

Quả th nấm C.militaris ngoài tự nhiên

Hệ sợi C.militaris sau khi phân lập

Hệ sợi C.militaris sau khi nhân giống cấp 1

Sinh khối hệ sợi sau nhân giống cấp 2

Phâ n lập

- Đo đường kính khuẩn lạc - Quan sát đặc đi m hệ sợi

Nhân giống cấp 1

- Đo đường kính khuẩn lạc

- Quan sát đặc đi m hệ

Nhân giống cấp 2

- Đo đường kính khuẩn lạc

- Khối lượng sinh khối hệ sợi - SLKL/10ml dịch - Quan sát đặc đi m hệ sợi Hộp cơ chất tổng hợp đã cấy giống và ủ tối Cấy giống, ủ Quả th nấm C.militaris Nuôi trồng tạo quả th - Thời gian ra quả th - Khối lượng quả th - K ch thước quả th - Màu s c quả th

- N m và phân loại các trạng thái, loại hình rừng hiện có trong khu vực nghiên cứu.

- Xác định hệ thống tuyến, địa đi m đi u tra, trên cơ sở các tài liệu v đặc đi m sinh vật học, sinh thái học của nấm như: m a vụ sinh trưởng; vị trí nấm thường mọc, độcao, độẩm, độ tàn che…

b) Điều tra ngoại nghiệp

Đi u tra được tiến hành vào các tháng m a mưa (từ tháng 5 đến tháng 8). Khảo sát thu m u được thực hiện trên các tuyến đi u tra ngoài thực địa qua các dạng địa hình, các dạng thực bì trong khu vực nghiên cứu. Các tuyến đi u tra được thiết kếđi men theo rìa suối, dọc theo khe, suối cạn và đường mòn hoặc dông núi từ dưới thấp lên cao và ngược lại. Trên tuyến đi u tra cứ 20 -30 (m) tiến hành 1 đi m đi u tra, hoặc phát hiện địa đi m có đi u kiện thuận lợi cho nấm đông tr ng hạthảo phát tri n thì tiến hành khoanh v ng và đi u tra tỷ mỷ. Tại các đi m đi u tra tiến hành đi u tra kỹ ph a dưới thân cây đổ, dưới lớp lá mục và các khoảng đất trống trong rừng. Phát hiện được m u nấm tiến hành đào thu m u nấm k cả côn trùng bị ký sinh còn d nh; đánh số hiệu, chụp ảnh, đo đếm k ch thước mô tả đặc đi m hình thái của nấm, côn trùng bị k sinh và các đặc đi m của địa đi m thu m u…

Các khu vực thu thập có sự khác biệt nhau v độcao. Độ cao là yếu tố quyết định đến ki u khí hậu và thực vật. Theo các tài liệu của các nhà khoa học trên thế giới cho thấy nấm ĐTHT thường xuất hiện ở độ cao trên 1000m. Đây là độ cao lí tưởng cho nấm sinh trưởng và phát tri n. Vườn Quốc Gia Hoàng Liên nằm ở núi cao, có ki u khí hậu và thảm thực vật khác nhi u so với các khu vực khác. Với độ cao trung bình 1.500m- 2500m so với mặt nước bi n, vì vậy thành ph n loài nấm ĐTHT rất khác so với các VQG và Khu Bảo tồn thiên nhiên khác của Việt Nam.

M u nấm sau khi thu hái, được bọc trong lá cây hoặc giấy khô, m m, tránh không làm tổn thương đến nấm và bỏ vào ống fancol bảo quản trong th ng đựng đá đưa v phòng thí nghiệm đ giám định, nghiên cứu các đặc đi m giải ph u, bào t và phân lập thu n khiết nấm.

(2) Phương pháp định danh loài nấm Cordyceps militaris bằng phân tử.

a) Phương pháp tách DNA tổng số

1. Nghi n 0,2g m u bằng cối chày sứtrong nitơ lỏng cho đến khi tạo ra bột thật mịn, sau đó chuy n ngay vào ống eppendorf 2ml, gi trong đá.

2. Bổ sung 800 l đệm chiết, l c đ u và ủở 65oC trong 1 giờ (cứ15 phút đảo đ u 1 l n).

3. Gi m u ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 phút.

4. Bổ sung 800 l Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) vào m u, l c đ u và gi ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 phút.

5. Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong thời gian 15 phút ở 4oC. 6. Dùng pipet hút chuy n dịch nổi sang ống eppendorf 1,5ml.

7. Bổ sung một th t ch tương đương Isopropanol tuyệt đối (lạnh) và đảo nhẹ, gi m u trong đá 30 phút.

8. Ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 15 phút ở 4oC.

9. Loại dịch nổi, r a DNA bằng cách thêm 500 l cồn 70%, ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 4 phút ở 4oC sau đó nhẹ nhàng loại bỏ ethanol

10. Làm khô DNA bằng quạt gió, máy hút chân không 11. Hoà tan trong 100 l H2O kh ion.

12. Sau khi DNA được hoà tan hoàn toàn thì bổ sung 3 l RNase (10mg/ml). Gi sản phẩm ở 37oC trong thời gian 1 giờ.

13. Điện di ki m tra DNA tổng số trên gel agarose 0,8%. b) Phương pháp PCR s dụng cặp mồi đặc hiệu

Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi ITS2 và ITS5 có trình tự:

ITS2 (5′- GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′) ITS5 (5'- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG -3') Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước deion kh trùng 6 2 Maste mix 10 3 Template (100ng/µl) 2 4 Mồi F 10 pmol 1 5 Mồi R 10 pmol 1 Tổng 20

c) Phương pháp giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự:

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2,0% và tinh sạch bằng QiAquick gel extraction kit (Qiagen, Đức). Sản phẩm này được s dụng làm khuôn cho phản ứng giải trình tự trực tiếp hai chi u (mồi xuôi và mồi ngược).S dụng BigDye terminator cycler v3.1 và đọc kết quả trên hệ thống ABI 3500 XL (Applied Biosystems, Mỹ). Trình tự nucleotide của các chủng nấm được so sánh với các trình tự đã có trên Genbank, s dụng ph n m m BLAST trong NCBI (website http:www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Trình tự DNA sau khi đọc được hiệu chỉnh bằng m t với sự trợ giúp của ph n m m ChromasPro1.7.6 đ loại bỏ các vùng tín hiệu nhiễu. Các trình tựphân t ch được s p xếp thẳng hàng bằng ph n m m Bioedit v7.0.5.2, Clustal W, geneDoc Các vùng không có khảnăng s p xếp bị loại bỏtrước khi phân tích. Thành phần Chiều F Chiều R BigDye™ Terminator 3.1 Ready Reaction Mi 4 µL 4 µL

Forward primer (3,2 pmol) 1µL -

Reverse primer (3,2 pmol) - 1µL

Nước 4 µL 4 µL

Sản phẩm PCR 1µL 1µL

Tổng cộng 10 µL 10 µL

Đ xây dựng cây tiến hóa, xác định quan hệ di truy n bằng phương pháp Maximum Likehood, d liệu DNA được chuy n vào ph n m m Mega 6.0.6 (Tamura et al., 2013) và chúng được thực hiện với 1.000 l n lặp lại đ xác định giá trịủng hộ (bootstrap).

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật phân lập giống gốc nấm Cordyceps militaris militaris

M u quả th sau khi thu thập ngoài tự nhiên sẽ được đưa v phòng thí nghiệm Công Ty Cổ Ph n Dược Thảo Thiên Phúc, tại đây chúng tôi tiến hành phân lập giống thu n. Nuôi cấy trong đĩa petri chứa môi trường cơ bản PGA ở nhiệt độ phòng. Theo dõi và thống kê các chỉ tiêu: tỷ lệ m u sạch, tỷ lệ m u sạch tái sinh và đo đường kính khuẩn lạc sau các ngày nuôi m u.

Phương pháp phân lập m u:

Kh tr ng m u: Cho m u vào ống fancol, d ng cồn 70% l c trong 1 phút. Tiếp theo, d ng kháng sinh cefotaxim l c m u trong 2-3 phút (t y vào k ch thước m u). Sau mỗi l n l c với cồn và kháng sinh l c lại với nước cất vô tr ng 2-3 l n đ loại bỏ cồn và kháng sinh c n lại trên quả th nấm. D ng giấy thấm đ thấm khô b mặt sau đó bóc bỏ lớp vỏ quả th ngoài của quả th nấm bằng dao mổ và panh

C t m u: D ng dao mổ, c t ngang quả th thành các mảnh nhỏ có k ch thước 1,5-2mm;

Cấy m u: M u được cấy vào các đĩa petri có chứa môi trường PGA, mỗi đĩa cấy 1 m u. Trên mỗi đĩa petri có ghi tên m u và ngày phân lập. Sau khi cấy, d ng parafilm hàn k n miệng đĩa đ gi m u luôn trong đi u kiện vô tr ng.

Nuôi m u: M u được nuôi trong đi u kiện không có ánh sáng trong 15 ngày trên các giàn giá nuôi trồng

2.3.3. Phương phápnghiên cứu kỹ thuật nhân giống cấp 1 và cấp 2 nấm

Cordyceps militaris.

Phương pháp nhân giống cấp 1:

Cấy giống vào môi trường nghiên cứu bằng phương pháp cấy chấm đi m và đưa đi nuôi ở đi u kiện khác nhau trong 7,10,15 ngày, không có ánh sáng.

Phương pháp cấy chấm đi m được thực hiện như sau: d ng pank lấy một lượng t sợi nấm từ nh ng đĩa peptri đã được phân lập ở trên cấy vào môi trường đã chuẩn bị. Trên mỗi đĩa petri có ghi tên m u và ngày nhân giống. Sau khi cấy, d ng parafilm hàn k n miệng đĩa đ gi m u luôn trong đi u kiện vô tr ng.

Sau 7,10,15 ngày tiến hành chọn các chủng giống có hệ sợi đ u đẹp khuẩn lạc đạt đường kính 20mm trở lên, hệ sợi có màu tr ng, phát tri n đồng đ u v đường kính khuẩn lạc đ làm vật liệu cho quá trình nhân giống cấp 2.

2.3.3.1. Nhân giống cấp 1 trên môi trường thạch

a) Nghiên cứu ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng đến khảnăng sinh trƣởng của hệ sợi

Tiến hành cấy chấm đi m các m u trên 3 môi trường khác nhau: PDA, Hansen, Czapek-Dox, đi u chỉnh pH bằng 7, nuôi cấy ở 25oC, độ ẩm 80%, không chiếu sáng. Theo dõi sựsinh trưởng của hệ sợi thông qua việc đo khuẩn lạc các m u sau 7, 10, 15 ngày.

b) Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độđến khảnăng sinh trƣởng hệ sợi

Nhiệt độ là một trong các đi u kiện môi trường quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi sinh vật. Thí nghiệm tiến hành nuôi cấy nấm trong các thang nhiệt độ khác nhau 20oC, 25oC và 30oC. Tiến hành cấy chấm đi m các m u nấm

Cordyceps militaris, đem nuôi ở các thang nhiệt độ khác nhau, c ng đi u kiện độ ẩm và ánh sáng. Xác định sựsinh trưởng của hệ sợi thông qua việc đo đường kính sinh trưởng của khuẩn lạc sau 7, 10, 15 ngày.

2.3.3.2. Nhân giống cấp 2 trên môi trường lỏng

a) Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng tạo sinh khối nấm trong môi trường dịch lỏng

Vật liệu nuôi cấy là hệ sợi nấm thu được từ các thí nghiệm trên. Thí nghiệm được bố trí với các công thức môi trường khác nhau kí hiệu l n lượt là:

M1: 20g/l Glucose + 0,1g/l MgSO4.7H2O + 0,1g/l KH2PO4 + 5g/l cao nấm men + 3g/l Pepton

M2: 20g/l Glucose + 0,1g/l MgSO4.7H2O + 0,1g/l KH2PO4 + 5g/l cao nấm men + 5g/l Pepton

M3: 20g/l Glucose + 0,1g/l MgSO4.7H2O + 0,1g/l KH2PO4 + 5g/l cao nấm men + 7g/l Pepton

Tiến hành nuôi l c ở tốc độ 150 v ng/phút, c ng đi u kiện nhiệt độ, độ ẩm. Sau 7 ngày nuôi l c dịch, quan sát đặc đi m hệ sợi nấm và thu thập số liệu.

b) Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khảnăng tạo sinh khối nấm

trong môi trường dịch lỏng

Vật liệu nuôi cấy là hệ sợi nấm thu được từ các thí nghiệm trên. Môi trường nuôi cấy là s dụng môi trường vừa nghiên cứu ở thí trên. Thí nghiệm được bố trí trong c ng đi u kiện nhiệt độ, độẩm, và tốc độ l c thay đổi từ 100 - 200 vòng/phút. Sau 7 ngày nuôi l c dịch, quan sát đặc đi m hệ sợi nấm và thu thập số liệu.

2.3.4. Phương phápnghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng bằng cơ chất tổng hợp phù

hợp với Cordyceps militaris bản địa.

a) Ảnh hưởng của nguồn C

Đ xác định được nguồn Cacbon tối ưu cho sự sinh trưởng và phát tri n của quả th , chúng tôi đã tiến hành th nghiệm trên 3 loại môi trường với hàm lượng Glucose thay đổi: 20g, 25g, 30g. Sau đó chọn ra môi trường tối ưu nhất.

Chuẩn bị 30 hộp cho mỗi loại môi trường với thành ph n các chất được phối trộn theo bảng 2.1 dưới đây.

Các lọ được bao k n, đem kh tr ng trong nồi hấp ở nhiệt độ 1000

C trong thời gian 3h. Sau khi kh tr ng môi trường được làm nguội tự nhiên rồi mới cấy giống.

S dụng phương thức cấy đa đi m giống sản xuất ở cả 3 loại môi trường. Quan sát so sánh và ghi lại kết quả v tốc độ sinh trưởng hệ sợi và thời gian hình thành quả th ở cả 2 loại môi trường đ xác định môi trường tối ưu.

Đánh giá đặc đi m hình thái quả th , tiến hành đo k ch thước quả th và số lượng quả th /hộp ở mỗi công thức.

Bảng 2.2. Công thức phối trộn3 loại môi trƣờng nuôi cấy sợi nấm C.militaris

Môi trƣờng C1 Môi trƣờng C2 Môi trƣờng C2

Gạo lứt khô: 18g Gạo lứt khô: 18g Gạo lứt khô: 18g

Glucose: 20 gam Glucose: 25 gam Glucose: 30 gam 20ml gồm nước dừa, nước

chiết malt.

20ml gồm nước dừa, nước chiết malt.

20ml gồm nước dừa, nước chiết malt.

Nhộng tươi: 10 g nghi n nhỏ Nhộng tươi: 10g nghi n nhỏ Nhộng tươi: 10g nghi n nhỏ 2ml hỗn hợp vi lượng gồm: KH2PO4 0,5g/l, cao nấm men 1g/l, Pepton 3g/l 2ml hỗn hợp vi lượng gồm: KH2PO4 0,5g/l, cao nấm men 1g/l, Pepton 3g/l 2ml hỗn hợp vi lượng gồm: KH2PO4 0,5g/l, cao nấm men 1g/l, Pepton 3g/l

b) Ảnh hưởng của nguồn nito

Trong th nghiệm này nhóm nghiên cứu s dụng hàm lượng Glucose đã được nghiên cứu ở trên. Đ xác định được nguồn Ni tơ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát tri n của quả th , chúng tôi đã tiến hành th nghiệm trên 3 loại môi trường với hàm lượng Nhộng tằm thay đổi: 5g, 10g, 15g.

Bảng 2.3. Công thức phối trộn 3 loại môi trƣờng nuôi cấy sợi nấm C.militaris

Môi trƣờng N1 Môi trƣờng N2 Môi trƣờng N3

Gạo lứt khô: 18g Gạo lứt khô: 18g Gạo lứt khô: 18g

Nhộng tươi: 5 g nghi n nhỏ Nhộng tươi: 10g nghi n nhỏ Nhộng tươi: 15g nghi n nhỏ 20ml gồm nước dừa,

nước chiết malt.

20ml gồm nước dừa, nước chiết malt.

20ml gồm nước dừa, nước chiết malt.

2ml hỗn hợp vi lượng gồm: KH2PO4 0,5g/l, cao nấm men 1g/l, Pepton 3g/l 2ml hỗn hợp vi lượng gồm: KH2PO4 0,5g/l, cao nấm men 1g/l, Pepton 3g/l 2ml hỗn hợp vi lượng gồm: KH2PO4 0,5g/l, cao nấm men 1g/l, Pepton 3g/l

Tiến hành th nghiệm:

Chuẩn bị 30 hộp cho mỗi loại môi trường với thành ph n các chất được phối trộn theo bảng trên đây.

Các lọ được bao k n, đem kh tr ng trong nồi hấp ở nhiệt độ 1000C trong thời gian 3h. Sau khi kh tr ng môi trường được làm nguội tự nhiên rồi mới cấy giống.

S dụng phương thức cấy đa đi m giống sản xuất ở cả 3 loại môi trường. Quan sát so sánh và ghi lại kết quả v tốc độ sinh trưởng hệ sợi và thời gian hình thành quả th ở cả 2 loại môi trường đ xác định môi trường tối ưu nhất.