Chuẩn bị trang thiết bị gồm: Bếp từ đơn Goldsun BA2101GT công xuất 1650W; Tủ cấy vô tr ng thổi đứng TTS – V1000; Nồi hấp kh tr ng 150 l t dạng đứng; Máy l c ngang China HY-2; Tủ sấy 125l của hang Biobase; máy phun sương và các thiết bị đo pH, thiết bị đo nhiệt độ, độ ẩm không kh , thiết bị đo cường độ ánh sáng.
Chuẩn bị dụng cụ gồm: dụng cụ th nghiệm bao gồm: đĩa peptri, ống fancol 50ml, chai thủy tinh 300ml, chai thủy tinh 500ml, đũa thủy tinh, ca đong 1 l t (2 l t), dao, nạo, giá đựng.
Chuẩn bị nguyên liệu gồm: glucose; gạo lứt; khoai tây; agar; bột nhộng khô; nhộng tươi nghi n nhỏ; nước dừa; nước chiết malt.
Chuẩn bị hóa chất gồm: MgSO4.7H2O; KH2PO4; Cao nấm men; pepton;
2.5. Phƣơng pháp thu thập và xử lý số liệu
Các thí nghiệm được lặp lại 3 l n và số liệu thu thập được x lý bằng ph n m m excel.
Phần 3.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả thu thập và định danh loài nấm Cordyceps militaris
3.1.1. Kết quả điều tra thu thập mẫu tại VQG Hoàng Liên - Lào Cai
VQG Hoàng Liên là khu vực khá đa dạng v thành ph n nấm ĐTHT. Vườn Quốc Gia Hoàng Liên có ph n lớn các đỉnh núi có độ cao trung bình từ 2000- 2500m, đặc biệt có đỉnh núi Panxipăng cao 3.143m so với mực nước bi n, nhiệt độ trung bình năm 15,20
C vào m a đông có băng tuyết nhiệt độ khoảng -30C phù hợp với sự sinh trưởng và phát tri n của nấm ĐTHT. Theo đánh giá của các nhà khoa học, VQG Hoàng Liên là một trong nh ng trung tâm đa dạng sinh vật vào bậc nhất của Việt Nam, là nơi c n sót lại của nhi u loài đặc h u, quý hiếm được ghi trong sách đỏ Việt Nam và sách đỏ thế giới.
Qua quá trình thu thập m u tại VQG Hoàng Liên - Lào Cai chúng tôi đã thu thập được 12 m u trong độ cao khoảng 2200m. Các m u được xác định là
Cordyceps militaris khi dựa vào đặc đi m hình thái bên ngoài được k hiệu như sau: CM1, CM2, CM5, CM7, CM13, CM14, CM18, CM24, CM28, CM29, CM32, CM34.
Phân t ch các d n liệu hình thái bằng cách xác định loại vật chủ, các đặc đi m hình thái, màu s c, k ch thước thân nấm. Chúng tôi nhận thấy các m u nấm có hình thái đặc trưng của loài Cordyceps militaris, phân nhánh đơn cấp hoặc đa cấp, quả th có hình trụ, tr n, màu cam đậm, ph n đ u quả th có hình tr nvà có bào t phủ quanh.Các m u này được tìm thấy trong thảm lá cây mục, trên lá cây hoặc trong thân cây gỗ mục dưới gốc cây d , k sinh trên ấu tr ng bọ cánh vảy. Cụ th như sau:
(1) Mẫu nấm CM1
Đặc điểm hình thái: Dựa vào đặc đi m bên ngoài có th nhận định đây là m u nấm Cordyceps militaris, có màu cam hơi vàng, quả th nhọn v ph a đ u, 1/3 ph n đ u nấm có bào t bao xung quanh. Màu s c của cây nấm chia rõ hai màu, ph n chân nấm màu tr ng hơi vàng 1/5 chi u dài nấm, đỉnh sinh trưởng của nấm
chính là ph n sinh sản chứa các múi dạng gai có màu cam hơi vàng dài bằng 1/4 chi u dài của nấm. Nấm ký sinh trên nhộng.
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris ký sinh trên nhộng.
Hình 3.1. Hình ảnh mẫu nấm CM1 thu ngoài tự nhiên
Phân bố: Được tìm thấy trên rừng tự nhiên, nơi có độ ẩm 87%, dưới lớp lá mục khô, dưới gốc cây tre, sinh cảnh rừng hỗn giao cây gỗ và cây tre.
(2) Mẫu nấm CM2
Đặc điểm hình thái: Dựa vào đặc đi m bên ngoài có th nhận định đây là m u nấm Cordyceps militaris, mọc từ ph n đ u của con nhộng. Quả th nấm hơi già, bào t phát tán g n hết. Màu s c của cây nấm chia rõ 3 màu, ph n chân nấm màu vàng dài bằng 1/5 chi u dài của nấm, ph n tiếp tiếp theo ph n chân nấm có màu cam hơi vàng dài bằng 1/3 chi u dài của nấm, và ph n còn lại có màu tr ng dài bằng ½ chi u dài nấm, ph n nau có bào t bao xung quanh.
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris ký sinh trên nhộng sâu còn một lớp kén mỏng của sâu gi .
Hình 3.2. Hình ảnh mẫu nấm CM2 thu ngoài tự nhiên
Phân bố: Nấm được tìm thấy trên thân cây gỗ mục ven đường mòn ph n nhộng nằm trong thân cây chỉ nhìn thấy quả th nhô lên khỏi mặt đất, nơi có độ ẩm 90%, có lớp rêu bao xung quanh, sinh cảnh rừng hỗn giao cây gỗ và cây bụi có độ tàn che 3-4 m.
(3) Mẫu nấm CM5
Đặc điểm hình thái: Dựa vào đặc đi m bên ngoài có th nhận định đây là m u nấm Cordyceps militaris, nấm có màu da cam hơi vàng, quả th nấm có màu cam đậm, đ u quả th hơi nhọn d n, bào t nấm bao xung quanh 1/3 quả th , nấm đang ởgiai đoạn trưởng thành, bảo t b t đ u phát tán.
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris ký sinh trên nhộng còn nguyên kén và lớp lông của con sâu d .
Phân bố: Nấm được tìm thấy trong rừng tự nhiên, vị trí tìm thấy là dưới gốc cây d bị khô mục, nơi có độ ẩm thấp khoảng 90%, sinh cảnh rừng hỗn giao cây gỗ thấp và thảm cây bụi rêu xanh, ở độ cao 2200m.
Hình 3.3. Hình ảnh mẫu nấm CM5 thu ngoài tự nhiên (4) Mẫu nấm CM7
Đặc điểm hình thái: Dựa vào đặc đi m bên ngoài có th nhận định đây là m u nấm Cordyceps militaris này có màu vàng cam hơi nhạt, thân hơi dẹt, 1/3 đ u quả th nấm có bào t xung quanh, đ u quả th nhọn, 2/3 quả th còn lại có màu nhạt hơn, quả th nhọn d n v ph a đ u nấm. Nấm đang ở giai đoạn già, bào t đã phát tán g n hết.
Hình 3.4. Hình ảnh mẫu nấm CM7 thu ngoài tự nhiên
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris này ký chủ trên con nhộng của sâu tre.
Phân bố: Được tìm thấy dưới gốc tre trong rừng tự nhiên, xung quanh là lớp lá khô, rêu xanh và thảm thực vật cây bụi thấp, độẩm 83%, ởđộ cao 2200m.
(5) Mẫu nấm CM13
Hình 3.5. Hình ảnh mẫu nấm CM13 thu ngoài tự nhiên
Đặc điểm hình thái: Dựa vào đặc đi m bên ngoài có th nhận định đây là m u nấm Cordyceps militaris, nấm có hình thái là hình trụ thuôn, màu s c của nấm có màu da cam hơi vàng, đ u quả th nấm hơi nhọn, 1/2 quả th nấm có các bào t bao xung quanh nấm, 1/2 quả th còn lại không có bào t bao xung quanh, có màu nhạt hơn. Giai đoạn này bào t nấm chưa phát tán. Vị trí quả th mọc là đ u của con nhộng.
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris ký sinh trên con nhộng của sâu của loài cánh vẩy.
Phân bố: Nấm được tìm thấy trong rừng tự nhiên, vị trí tìm thấy là dưới lớp đất, có rêu, ởđộ cao 2000m, độẩm 90%.
(6) Mẫu nấm CM14
Đặc điểm hình thái: Dựa vào đặc đi m bên ngoài có th nhận định đây là m u nấm Cordyceps militaris, nấm có màu da cam hơi vàng, quả th nấm hình chuỳ, 1/4 chân nấm có màu tr ng hơi vàng, đ u quả th hơi nhọn d n, bào t nấm bao xung quanh 2/3 quả th , nấm đang ở giai đoạn b t đ u trưởng thành, bảo t b t đ u phát tán.
Hình 3.6. Hình ảnh mẫu nấm CM14 thu ngoài tự nhiên
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris ký sinh trên nhộng còn nguyên kén và lớp lông của con sâu d .
Phân bố: Nấm được tìm thấy trong rừng tự nhiên, vị trí tìm thấy là dưới gốc cây d bị khô mục, nơi có độ ẩm thấp khoảng 90%, sinh cảnh rừng hỗn giao cây gỗ thấp và thảm cây bụi rêu xanh, ở độ cao 2200m.
(7) Mẫu nấm CM18
Đặc điểm giải phẫu: Dựa vào đặc đi m hình thái bên ngoài có th nhận định là m u nấm Cordyceps militaris có màu vàng cam, hình trụ thuôn. Chân nấm màu tr ng hơi vàng, bằng 1/3 cây nấm, đ u nấm chứa các bào t màu vàng da cam. Ph n còn lại có màu vàng nhạt hơn. Quả th nấm mọc ở ph n đ u và bụng của ký chủ có khoảng 10 quả th . Nấm đang ở giai đoạn trưởng thành nên các bào t b t đ u xuất hiện và phát tán.
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris này ký sinh trên nhộng của sâu còn nguyên lớp kén bên ngoài.
Hình 3.7. Hình ảnh mẫu nấm CM18 ngoài tự nhiên
Phân bố: Được tìm thấy trên rừng tựnhiên, dưới gốc cây gỗ to, ven đường m n xung quang là rêu xanh bao quanh, độ ẩm 90%, độ cao 2200m, sinh cảnh hỗn giao cây gỗ và cây bụi.
(8) Mẫu nấm CM24
Hình 3.8. Hình ảnh mẫu nấm CM24 thu ngoài tự nhiên
Đặc điểm hình thái: Dựa vào đặc đi m bên ngoài có th nhận định đây là m u nấm Cordyceps militaris, nấm có màu da cam hơi vàng, quả th nấm hình chuỳ, 1/4 chân nấm có màu tr ng hơi vàng, đ u quả th màu vàng cam đậm, bào t nấm bao xung quanh đ u quả th , nấm đang ởgiai đoạn bảo t b t đ u phát tán.
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris ký chủ trên kén của nhộng
cây d bị khô mục, nơi có độ ẩm thấp khoảng 90%, sinh cảnh rừng hỗn giao cây gỗ thấp và thảm cây bụi rêu xanh, ở độ cao 2200m.
(9) Mẫu nấm CM28
Hình 3.9. Hình ảnh mẫu nấm CM28 ngoài tự nhiên
Đặc điểm hình thái, giải phẫu: Dựa vào đặc đi m hình thái ban đ u có th nhận định là m u nấm Cordyceps militariscó màu da cam hơi vàng, thân nấm hình dẹt, nhọn v ph a đ u của cây nấm, ph n đ u nấm có bào t bao xung quanh, chân nấm có màu tr ng. Nấm đang ở giai đoạn trưởng thành bào t b t đ u xuất hiện và phát tán. Nấm có 1 quả th duy nhất to, dài hơi dẹt mọc ở ph n bụng của ký chủ.
Ký chủ: Cây nấm Cordyceps militaris CM28 ký chủ trên con nhộng của sâu tre.
Phân bố: Được tìm thấy trên rừng tự nhiên dưới lớp lá mục khô ở dưới gốc cây tre, xung quanh là các cây bụi thấp, có độẩm 90%, ởđộ cao 2200m.
(10) Mẫu nấm CM29
Đặc điểm hình thái: Dựa vào đặc đi m bên ngoài có th nhận định đây là m u nấm Cordyceps militaris, nấm có hình dạng là hình chuỳ, nấm có màu vàn cam, vị trí quả th của nấm mọc trên ký chủ là cuối bụng của con nhộng. Đặc đi m quả th nấm khi phân lập có màu tr ng, bông xốp.
Hình 3.10. Hình ảnh mẫu nấm CM29 thu ngoài tự nhiên
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris ký sinh trên nhộng, vị trí mọc là cuối bụng của con nhộng.
Phânbố: Nấm được tìm thấy trong rừng tự nhiên, vị trí tìm thấy dưới lớp lá khô trong rừng, ởđộ ẩm cao 87%, độ cao 2100m.
(11) Mẫu nấm CM32
Hình 3.11. Hình ảnh mẫu nấm CM32 ngoài tự nhiên
Đặc điểm hình thái: Dựa vào đặc đi m hình thái bên ngoài có th nhận định đây là m u nấm Cordyceps militaris. Nấm có màu vàng da cam, quả th hình trụ thuôn, đ u quả th thuôn, 2/3 quả th nấm ở ph n đ u nấm có màu vàng cam có các bào t bám xung quanh, ở gi a là thân nấm hình trụ thuôn có màu vàng nhạt hơn, còn lại là chân nấm có màu tr ng hơi vàng. Nấm đang ở giai đoạn b t đ u trưởng thành b t đ u phát tán bào t .
Ký chủ: Nấm Cordyceps militaris này ký chủ trên nhộng còn nguyên kén của sâu tre.
Phân bố: Được tìm thấy trên rừng tự nhiên, dưới gốc cây tre xung quanh được bao bởi các lớp rêu xanh, với độẩm 90%, ở độ cao khoảng 2200m, sinh cảnh rừng hỗn giao cây gỗvà cây tre, độ tàn che 5-7m.
(12) Mẫu nấm CM34
Đặc điểm hình thái, giải phẫu: Dựa vào đặc đi m bên ngoài có th nhận định đây là m u nấm Cordyceps militaris, nấm có màu vàng nhạt, có 6 quả th nấm trên một ký chủ. Nấm Cordyceps militaris có hình dạng là hình trụ, có quả là hình chuỳ. Vị trí quả th mọc là ph n đ u, bụng, và cuối ph n bụng của ký chủ. Bào t nấm bao xung quanh đ u quả th , bào t đang trong quá trình phát tán.
Hình 3.12. Hình ảnh mẫu nấm CM34 ngoài tự nhiên
Ký chủ: Nấm ký sinh trên nhộng của sâu tre v n còn nguyên kén có lá khô bao xung quanh.
Phân bố: Nấm được tìm thấy trong rừng tự nhiên, vị trí tìm thấy dưới gốc cây tre, dưới lớp lá khô dày phủ chỉ thấy một ph n của đ u quả th nhô lên. Ởđộẩm 85%, độ cao 2100 m, sinh cảnh rừng hỗn giao các cây gỗto và cây tre, độ tàn che khoảng 5-7 m.
3.1.2. Kết quả định danh loài nấm Cordyceps militarisbằng phân tử
(1) Chủng nấm CM1
DNA của chủng nấm CM1 đã tinh sạch được định tên theo phương pháp sinh học phân t bằng kĩ thuật PCR bằng 2 cặp mồi đặc hiệu tại Công ty TNHH Phát tri n Công nghệỨng dụng Việt Nam. Kết quảthu được trình tự của chủng CM1 như sau:
GGCCNTTGCTTAGTTCAGCGGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTC AGCGTTCATAGTTGGGTGTTTTACGGCGTGGCCGCGCCCGGGTCCCGGT GCGAGTTGGAGTACTGCGCAGAGGTCGCCGCGGGCGGGCCGCCACTTC ATTTCGGGGGCGGCGGTGTGCTGCCGGTCCCCAACGCCGACGTCCCCTG GGGGGCGTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGA ATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATT CTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCA GAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTATTTGTTTTGCCTTGCG GCGGATTCAGAAAAACTGGTAGATGCAGGATGTAGAGGTCCCCGGCGG CCGCTGGGCGAGTCCGCCGAAGCAACAATAGGTATGTTCACAAAGGGTT GGGAGTTGGAAAACTCGCTAATGATCCCTCCGCAGGTTCACCTACGGAA CTGGCCGTTCGTTATTACA
Hình 3.13. Kết quả so sánh trình tự gen chủng CM1 trên BLAST NCBI
Trình tự gen vùng ITS của chủng nấm CM1 có k ch thước là 545 Nucleotide. Khi so sánh trình tựgen đã nhận được trong nghiên cứu với trình tự gen tương ứng trên ngân hàng cơ sở d liệu GenBank cho thấy các mức độtương đồng khác nhau.
Bảng 3.1. Mức độ tƣơngđồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM1 với các trình tự tƣơng đồng ở GeneBank
STT Chủng nấm Mức độtƣơng
đồng (%)
Mã số truy cập gen banks
1 Cordyceps militaris strain 0153 94,92 JX488473.1 2 Cordyceps ningxiaensis isolate
HMJAU25076
92,46 KF309670.1 3 Cordyceps ningxiaensis isolate
Dựa vào mức độ tương đồng trình tự vùng gen ITS của chủng nấm CM1 sau khi so sánh trên ngân hàng NCBI BLAST, xây dựng được cây di truy n như sau
Hình 3.14. Sơ đồ cây di truyền đối với chủng CM1
Từ kết quả so sánh mức độtương đồng kết hợp với xây dựng cây di tuy n từ trình tự vùng gen ITS của chủng CM1, chủng CM1 được định tên là Cordyceps militaris.
(2) Chủng nấm CM2
DNA của chủng nấm CM2 đã tinh sạch được định tên theo phương pháp sinh học phân t bằng kĩ thuật PCR bằng 2 cặp mồi đặc hiệu tại Công ty TNHH Phát tri n Công nghệ Ứng dụng Việt Nam. Kết quả thu được trình tự của chủng CM2 như sau: CGCNGCGGAGGTCATTAGCGAGTTTTCCAACTCCCAACCCTTTGTGA ACATACCTATTGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCAGCGGCCGCCGGGGACCTC TATATCCTGCATCTACCAGTTTTTCTGAATCCGCCGCAAGGCAGAACAAAT AATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACG CAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGA ATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTC GAGCGTCATTTCAACCCTCGACGCCCCCCAGGGGACGTCGGCGTTGGGGAC CGGCAGCACACCGCCGCCCCCGAAATGAAGTGGCGGCCCGCCCGCGGCGA CCTCTGCGCAGTACTCCAACTCGCACCGGGACCCGGGCGCGGCCACGCCGT AAAACACCCAACTATGAACGCTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCT GAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAGTCATAGCTGGNNNTCCTG
Hình 3.15. Kết quả so sánh trình tự gen chủng CM2 trên BLAST NCBI
Trình tự gen vùng ITS của chủng nấm CM2 có k ch thước là 545 Nucleotide. Khi so sánh trình tựgen đã nhận được trong nghiên cứu với trình tự gen tương ứng trên ngân hàng cơ sở d liệu GenBank cho thấy các mức độtương đồng khác nhau.
Bảng 3.2. Mức độ tƣơng đồng trình tự gen vùng ITS từ chủng CM2 với các trình tự tƣơng đồng ở GeneBank STT Chủng nấm Mức độtương đồng (%) Mã số truy cập gen banks 1 Cordyceps militaris 18S 91,56 MK209600.1
2 Cordyceps militaris strain C-1 91,56 EU825992.1
3 Cordyceps militaris strain
M150613 91,55 KU351817.1
Dựa vào mức độ tương đồng trình tự vùng gen ITS của chủng nấm CM2 sau khi so sánh trên ngân hàng NCBI BLAST, xây dựng được cây di truy n như hình dưới dây:
Hình 3.16. Sơ đồ cây di truyền đối với chủng CM2
Từ kết quả so sánh mức độ tƣơng đồng kết hợp với xây dựng cây di tuyền từ trình tự vùng gen ITS của chủng CM2, chủng CM2 đƣợc định tên là
Cordyceps militaris.
(3) Chủng nấm CM5
Không xác định được -> m u l n nhi u tạp chất
4) Chủng nấm CM7
DNA của chủng nấm CM7 đã tinh sạch được định tên theo phương pháp sinh học phân t bằng kĩ thuật PCR bằng 2 cặp mồi đặc hiệu tại Công ty TNHH Phát tri n Công nghệỨng dụng Việt Nam. Kết quảthu được trình tự của chủng CM7 như sau:
GGCCNATGCTTAGTTCAGCGGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTC AGCGTTCATAGTTGGGTGTTTTACGGCGTGGCCGCGCCCGGGTCCCGGT GCGAGTTGGAGTACTGCGCAGAGGTCGCCGCGGACGGGCCGCCACTTC ATTTCGGGGGCGGCGGTGTGCTGCCGGTCCCCAACGCCGACGTCCCCTG GGGGGCGTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGA ATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATT CTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCA GAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTATTTGTTCTGCCTTGCG GCGGATTCAGAAAAACTGGTAGATGCAGGATGTATAGGTCCCCGGCGG CCGCTGGGCGAGTCCGCCGAAGCAACAATAGGTATGTTCACAAAGGGTT GGGAGTTGGAAAACTCGCTAATGATCCCTCCGCAGGTTCACCTACGGAA CTGGCCGTTCGTTTTACA
Dựa vào mức độtương đồng trình tự vùng gen ITS của chủng nấm CM7