Phương pháp xét nghiệm PCR (Polymerase Chain Reaction).

- Teo nặng: số lượng tuyến giảm nhiều hoặc mất hết, có DSR lan rộng.

2.2.5. Phương pháp xét nghiệm PCR (Polymerase Chain Reaction).

Mảnh sinh thiết được giữ lạnh - 20oC trong cồn tuyệt đối. Khi kết quả xét nghiệm trên MBH và CLOtest đều dương tính, chúng tôi mới gửi bệnh phẩm đi xét nghiệm PCR.

Kỹ thuật PCR được thực hiện tại Labo trung tâm Y sinh học trường Đại học y Hà Nội.

Các mẫu sinh thiết được lưu giữ trong tủ đá trong 1 tuần rồi gửi đi bảo quản để làm xét nghiệm PCR ở Labo trung tâm trường ĐH Y HN.

Mồi (Primer) dùng cho các gen CagA, VacA s1 và chu trình nhiệt được làm theo Yamaoka [61].

Mảnh sinh thiết được nghiền nhỏ rồi cho vào dung dịch tách chiết DNA vào, sau đó dùng dung dịch phenol/ chloroform/ isoamyl alcohol (tỷ lệ 25: 24: 1) để kết tủa protei. DNA trong dung dịch nổi được kết tủa bằng cồn tuyệt đối, ly tâm lấy cặn, rửa cặn làm khô hòa tan cặn bằng TE. Đây là dung dịch DNA để làm PCR.

Thành phần trình tự mồi như sau:

Vi khuẩn Primer (mồi) Trình tự mồi: 5’- 3’ Số Nucleotide Kích thước sản phẩm PCR

CAGA- F GAT AAC AGG CAA GCT TTT GAG G 22 CagA 349 bp CAGA- R CTG CAA AAG ATT GTT TGG CAG A 22

VACA- F ATG GAA ATA CAA CAA ACA CAC 21 VacA 259 bp VACA- R CTG CTT GAATGC GCC AAA C 19

Dung dịch tham gia phản ứng PCR được pha chế từ “Ready-To-Go TM PCR beads” (Amersham pharmacia Biotech, Inc., USA). Đây là những hạt (beads) khô, khi thể tích cuối cùng là 25l thì chứa 200 m cho mỗi loại

32

dNPT (Deoxyribonucleotide triphotphate); 1,5 M MgCl2, 10 M Tris HCl, 50M KCl và 1,5 đơn vị Taq DNA polymerase. Nồng độ của mỗi primer là 1

M . Phản ứng được chạy với 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm: 95oC/ 1 phút, 52oC/ 1 phút và 72oC/ 1 phút. Sản phẩm của PCR được điện di với agarose 1,5% trong dung dịch đệm TAE 1* trên máy điện di ngang Mupid II (Nhật). Sau khi điện di xong bản thạch agarose được nhuộm trong Ethidium bromide rồi soi dưới tia UV và chụp ảnh.

Chứng: Dương tính: ATCC 43504 (CagA và VacA s1 dương tính). Âm tính : 446 D (CagA và VacA s1 âm tính).

Vạch sỏng trờn Vạch sáng dưới

Ảnh 2.2: Xét nghiệm PCR Đọc kết quả: CagA (+) : vạch sáng trên; VacA (+): vạch sáng dưới;

CagA (-) : không có vạch sáng trên; VacA (-) : Không có vạch sáng dưới.