a, Hóa chất tách DNA:
-Bộ Genomic DNA purification Kit của hãng Fermentas được dùng để tách DNA tổng số.
-Ngoài ra còn sử dụng thêm các hóa chất khác: TE 1X (Tris-HCl 10mM, pH 7,5; EDTA 1mM), Chloroform, cồn…). b, Hóa chất cho phản ứng PCR - H2O dùng cho phản ứng PCR - Buffer 10X - MgCl2 25mM - dNTP 2mM - Mồi sinh học
c, Hóa chất tách dòng gen:
- Bộ TOPO TA cloning Kit để tạo dòng của hãng Invitrogen. Trong bộ Kit gồm có các thành phần dùng cho quá trình tách dòng, vectơ pCR TOPO 2.1, các enzyme và dung dịch đệm cho từng loại enzyme, tế bào khả biến E. coli DH5α.
- Kanamycine, X-gal.
d, Hóa chất tách plasmid:
Bộ AccuPrep®Plasmid Mini Extraction Kit để tách plasmid DNA của hãng BioNEER.
e, Hóa chất điện di:
- Agarose - 6X Loading Dye - Ethidium Bromide - Marker f, Dung dịch đệm TAE 5X - Tris base: 242g
- Glacial actic acid: 57,1 ml - EDTA 0,5M, pH 8,0: 100ml 2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn trên môi trường King A
Nước nuôi thủy sản được pha loãng tới các đậm độ từ 10-1 tới 10-3, sau đó cấy trải 0,1ml dung dịch pha loãng lên môi trường thạch King A và ủ ở 30oC. Sau 24 giờ tiến hành nhặt những khuẩn lạc màu xanh và làm môi trường chuyển sang màu xanh để thực hiện tiếp các thí nghiệm sau.
2.2.1.2 Phương pháp nhuộm tế bào quan sát hình thái của vi khuẩn
Nhuộm Gram là phương pháp quan trọng và phổ biến để phân loại vi khuẩn, dựa vào khả năng bắt màu của tế bào vi khuẩn với thuốc nhuộm. Do đặc điểm cấu tạo của thành tế bào vi khuẩn Gram âm và Gram dương là khác nhau nên khả năng bắt màu của chúng cũng khác nhau. Phương pháp này do Gram đề xuất năm 1884 đã được Hucker cải tiến để phát hiện vi khuản theo các bước sau:
Bước 1: Làm một vết bệnh phẩm hoặc vi khuẩn trên một lam sạch. Để khô tự nhiên và cố định bằng cách hơ nóng qua ngọn lửa đẩn cồn.
Bước 2: Nhỏ vài giọt Crystal Violet cho phủ đều lên trên bề mặt phết nhuộm và để yên trong 1 phút. Sau đó rửa nhanh bằng nước.
Bước 3: Nhỏ vài giọt Lugol cho phủ đều trên bề mặt phết nhuộm và để yên trong 1 phút rồi rửa nhanh bằng nước.
Bước 4: Tẩy màu bằng cách nghiêng lame và nhỏ từ từ cồn lên phết nhuộm, khi giọt cồn rời khỏi lame không có màu tím thì ngừng ngay. Rửa nhanh bằng nước.
Bước 5: Nhỏ vài giọt Safranin cho phủ đều trên bề mặt phết nhuộm và để yên trong 1 phút. Rửa nhanh bằng nước.
Bước 6: Thấm khô phết nhuộm và quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu độ phóng đại 1000 lần.
Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím và vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng. 2.2.1.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme của vi khuẩn
- Chuẩn bị các môi trường xác định hoạt tính enzyme.
- Cấy vi khuẩn đã được làm giàu lên các môi trường đó, ủ các vi khuẩn ở 30oC qua đêm và quan sát kết quả thí nghiệm.
- Kiểm tra hoạt tính amylase (cơ chất là tinh bột tan) bằng cách nhuộm dung dịch Lugol vào đĩa thạch. Quan sát kết quả nếu thấy xuất hiện vùng phân giải
quanh khuẩn lạc thì xác định chủng vi khuẩn đó có hoạt tính enzyme amylase, ngược lại sẽ không có hoạt tính.
- Kiểm tra hoạt tính Protease (cơ chất là casein), Gelatinase (cơ chất là Gelatin) bằng cách nhuộm đĩa thạch với Trichloroacetic acid (TCA). Nếu ta thấy xuất hiện vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc thì ta kết luận chủng vi khuẩn có hoạt tính enzyme Protease, Gelatinase và ngược lại nếu ta không thấy xuất hiện vùng trong suốt thì kết luận chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính enzyme đó.
- Kiểm tra hoạt tính Lipase (cơ chất là Tween 80), nếu ta thấy xung quanh khuẩn lạc đục lên thì ta kết luận chủng vi khuẩn đó có hoạt tính enzyme Lipase.
2.2.1.4. Phương pháp lập kháng sinh đồ
Vi khuẩn được nuôi trên môi trường NB lỏng ở 30oC trong 24 giờ, có lắc. Sau 24 giờ, hút 100µl dịch vi khuẩn chang đều lên đĩa thạch NB và để khô tự nhiên trong 5-10 phút. Sau đó dùng kẹp khử trùng gắp khoanh giấy có tẩm kháng sinh đặt lên đĩa thạch rồi ủ đĩa ở tủ ấm 30oC trong 24 giờ. Tiến hành đo đường kính vòng vô khuẩn (D-d, mm) (trong đó D là đường kính vòng vô khuẩn, d là đường kính khoanh giấy) để xác định khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn.
Kháng sinh sử dụng trong nghiên cứu gồm: Tetracyclin (TE), Ampicillin (AM), Penicillin (PG), Kanamicun (KM), Gentamicin (GM) và Microcin.
2.2.1.5. Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn:
Pha loãng mẫu với các đậm độ pha loãng khác nhau: 10-3, 10-4,10-5. Hút 100µl dung dịch pha loãng cho vào đĩa petri chứa môi trường thạch NB (mỗi nồng độ 3 đĩa), chang đều và để khô tự nhiên trong 5-10 phút, ủ ở 30oC trong 24 giờ. Sau 24 giờ, chọn những đĩa có số khuẩn lạc khoảng 15 – 300 khuẩn lạc ở các đĩa của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp. Tính mật độ vi khuẩn có trong 1 ml mẫu bằng cách tính trung bình cộng tổng số khuẩn lạc của các đĩa trên theo công thức sau:
d n n C N ). . 1 , 0 ( 1 2
Trong đó: N: mật độ vi khuẩn có trong 1ml mẫu (CFU/ml) C: số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn.
n1, n2: Số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ 1, thứ 2. d: Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng đã chọn thứ 1.
2.2.1.6. Phương pháp tách chiết và xác định sắc tố pyocyanin - PCN [32] Vi khuẩn được làm giàu trên môi trường NB lỏng ở 30oC, lắc 200 vòng/phút Vi khuẩn được làm giàu trên môi trường NB lỏng ở 30oC, lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ. Sau đó, vi khuẩn được cấy chuyển sang 20ml môi trường King A lỏng với tỷ lệ giống 1%, lắc 200 vòng/phút ở 30oC. Dịch nuôi vi khuẩn được ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi, loại bỏ tế bào, thêm chloroform theo tỷ lệ 1:2, lắc đều, loại bỏ phần dịch trên, thu lớp chloroform. Sau đó sử dụng 0,2M HCl để acid hóa, dung dịch chuyển sang màu đỏ được đo OD bước sóng 520 nm để xác định nồng độ hoạt chất. Trung hòa dịch chiết acid bằng NaOH và thu được dung dịch PCN có màu xanh dương.
2.2.1.7. Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối và nồng độ hoạt chất của vi khuẩn khối và nồng độ hoạt chất của vi khuẩn
Vi khuẩn được làm giàu trên môi trường NB lỏng ở 30oC, lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ. Sau đó, vi khuẩn được cấy chuyển sang 20ml môi trường King A lỏng với tỷ lệ giống 1%, lắc 200 vòng/phút ở 30oC. Sau thời gian: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ngày tiến hành xác định mật độ vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc và tách chiết, xác định nồng độ hoạt chất PCN bằng phương pháp đo OD.
2.2.1.8. Phương pháp xác định khả năng kháng Vibrio sp:
a, Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch:
Các chủng vi khuẩn Vibrio sp được làm giàu trên môi trường APW, sau đó
hút dịch sinh khối vi khuẩn Vibrio sp đã được hoạt hóa lên đĩa petri chứa môi
trường thạch 2216E, sau đó chang đều cho đến khi khô hết. Đặt khoanh giấy có tẩm sẵn dịch nuôi, dịch chiết theo thời gian nuôi cấy chủng Pseudomonas sp và khoanh giấy có tẩm kháng sinh Tetracyclin làm đối chứng để xác định khả năng kháng khuẩn; các khoanh giấy có nồng độ PCN khác nhau 0,5µg, 1µg và 2µg để xác định nồng độ tối thiểu ức chế Vibrio sp của hoạt chất PCN. Đĩa được nuôi ở nhiệt độ thích hợp với từng chủng. Sau 24 giờ tiến hành xác định khả năng ức chế
Vibrio sp bằng cách đo đường kính vòng kháng khuẩn (D-d, mm); trong đó D là đường kính vòng vô khuẩn, d là đường kính khoanh giấy.
b, Phương pháp nuôi lỏng:
Các chủng vi khuẩn Vibrio sp được làm giàu trên môi trường APW, sau đó cho vào trong tủ lắc 30ºC, thời gian 24h để hoạt hóa chủng. Sau 24 giờ tiến hành thu sinh khối, xác định mật độ vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch. Pha loãng dung dịch vi khuẩn với đậm độ pha loãng là 10-3, xác định mật độ vi khuẩn ban đầu bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch , sau đó bổ sung hoạt chất với các nồng độ 0,5µg/ml, 1µg/ml và 2µg/ml và một mẫu đối chứng không bổ sung hoạt chất, nuôi lắc ở 30oC. Sau 6 giờ và 24 giờ thu mẫu, xác định mật độ vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, so sánh với mẫu đối chứng để xác định khả năng ức chế Vibrio sp.
2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử
2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
DNA trong hệ gen của chủng vi khuẩn phân lập được được tách chiết để làm nguyên liệu cho quá trình giải trình tự gen và làm khuôn cho phản ứng PCR nhân đoạn gen cần nghiên cứu. DNA được tách theo kit Genomic DNA Purification Kit của hãng Fermentas.
Bước 1: Trộn đều 100µl mẫu (30mg mẫu thêm 100µl TE 1X) đã chuẩn bị với 500µl dung dịch 1, ủ hỗn hợp ở 70oC trong 5 phút, làm nguội đến nhiệt độ phòng.
Bước 2: Thêm 600µl dung dịch chloroform, votex hỗn hợp cho tới khi chuyển màu trắng sữa và li tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút.
Bước 3: Chuẩn bị dung dịch kết tủa DNA 800µl (theo tỷ lệ 1/10: hòa 80µl dung dịch 2 với 720µl nước khử ion đã khử trùng).
Bước 4: Dùng pipet hút 300µl dung dịch pha trên cùng sang ống chứa 800µl dung dịch kết tủa DNA ở trên. Trộn đều hỗn hợp, để 1-2 phút ở nhiệt độ phòng, li tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút.
Bước 5: Bỏ dịch nổi, hòa tan tủa trong 150µl dung dịch 3, votex trong 10 giây đến khi hòa tan hoàn toàn tủa dưới đáy ống.
Bước 6: Thêm 450 µl cồn tuyệt đối, trộn đều, để hỗn hợp ở -20oC trong 10 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Bỏ dịch nổi, thêm 500µl cồn 75%, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút. Loại hết cồn và làm khô DNA, hòa tan DNA trong 50µl dung dịch TE 1X, kiểm tra độ sạch và xác định hàm lượng DNA bằng đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 280nm và 260nm và điện di trên gel agarose 1%.
2.2.2.2. Phương pháp PRC khuếch đại gen
Được phát minh vào năm 1985 và được thừa nhận chính thức năm 1993 qua giải thưởng Nobel y dược và sinh lý cho Kary Mullis – người phát minh ra nó. PCR hiện đang được ứng dụng rộng rãi ở Việt Nam.
a, Phản ứng PCR khuếch đại gen 16s rRNA để định danh vi khuẩn:
- Trình tự mồi: sử dụng cặp mồi 27F và 1525R để định danh vi khuẩn bằng gen16s rRNA. Trình tự của mồi như sau:
27F: 5’ –CGGTTACCTTGTTACGACTT – 3’ 1525R: 5’–AGGAGGTGATCCAGCC – 3’
- Thành phần phản ứng Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR: STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O 13,5 2 Buffer PCR KCl 10X 2,5 3 MgCl2 (25mM) 1,5 4 dNTPs (2mM) 2,5 5 Mồi xuôi 27F (10mM) 1 6 Mồi ngược 1525R (10mM) 1
7 Taq polymerase (1u/µl) 1
8 DNA 2
Tổng 25
- Chu trình phản ứng: biến tính 94o C: 3 phút; lặp lại 35 chu kỳ: 94oC-20 giây; 55oC-30 giây và 72oC-45 giây. Ở chu kỳ cuối cùng bước tổng hợp kéo dài 5 phút, sau đó giữ mẫu ở 4oC.
b, Phản ứng PCR khuếch đại gen PA phát hiện P. aeruginosa
- Trình tự mồi: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu trên gen 16S rRNA có độ đặc hiệu và độ nhạy 100% với chủng P. aeruginosa khuyếch đại đoạn gen 956bp [86].
Trình tự cặp mồi: PA-F: 5’ - GGGGGATCTTCGGACCTCA - 3’ PA-R: 5’ TCCTTAGAGTGCCCACCCG - 3’ - Thành phần phản ứng: Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O 13,5 2 Buffer PCR KCl 10X 2,5 3 MgCl2 (25mM) 1,5
4 dNTPs (2mM) 2,5
5 Mồi xuôi PA-F (10mM) 1
6 Mồi ngược PA-R (10mM) 1
7 Taq polymerase (1u/µl) 1
8 DNA 2
Tổng 25
- Chu trình phản ứng: biến tính 94o C: 5 phút; lặp lại 35 chu kỳ: 94oC-30 giây; 58oC-30 giây và 72oC-45 giây. Ở chu kỳ cuối cùng bước tổng hợp kéo dài 5 phút, sau đó giữ mẫu ở 4oC.
2.2.2.3. Phương pháp điện di
Các bước tiến hành:
- Chuẩn bị thạch agarose 1%: cân 1g agarose cho vào 100ml đệm điện di TAE 1X. Đun nóng cho tới khi gel chảy hoàn toàn trong suốt (không có bọt khí). Để nguội tới nhiệt độ 50o sau đó đổ gel vào khuôn có gài sẵn lược để tạo giếng (gel có độ dày 2-3mm). Sau khi gel đông (khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng) cẩn thận rút lược ra và có thể điện di (lưu ý: không để gel ở nhiệt độ phòng quá 4 giờ). Gel sau khi chuẩn bị phải ngâm chìm trong dung dịch đệm điện di TAE 1X.
- Trộn đều 4µl sản phẩm PCR với 1µl đệm tải điện di (loading dye) rồi tra vào các giếng trên gel.
- Tra 4,5µl DNA Marker vào giếng thạch khác để tạo thang chuẩn. - Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong vòng 25-30 phút.
- Nhuộm bản gel bằng Ethidium bromide (5-10 phút), rửa lại bằng nước rồi cho gel vào máy tử ngoại để đọc kết quả.
Đọc kết quả
Sau khi nhuộm với Ethidium bromide, lấy gel cho vào máy tử ngoại đọc kết quả (so sánh với đối chứng và thang chuẩn).
2.2.2.4. Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR
Trước khi tách dòng và giải trình tự, sản phẩm PCR được làm sạch bằng bộ Kit Bioneer. Các bước làm sạch như sau:
Bước 1: Điện di các mẫu cần làm sạch trên gel agarose 1%, đệm TAE 1X. Bước 2: Cắt gel tại vị trí có băng DNA cho vào ống eppendorf và cân trọng lượng miếng gel.
Bước 3: Bổ sung dung dịch Buffer 1 với tỉ lệ 3:1 (VD: nếu trọng lượng miếng gel là 200mg thì ta phải thêm 600µl Buffer 1).
Bước 4: Tiến hành ủ ống eppendorf có chứa đoạn gel trên ở 60oC trong vòng 10 phút và trộn đều trong khi ủ cho gel tan hoàn toàn.
Bước 5: Sau khi gel đã tan hết, kiểm tra màu sắc của dung dịch có màu vàng là đạt yêu cầu. Nếu hỗn hợp có màu cam hoặc đỏ, bổ sung thêm 10µl sodium acetate 3M (CH3COONa), pH 5 và trộn đều thì dung dịch sẽ chuyển thành màu vàng.
Bước 6: Chuyển dung dịch sang cột và li tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 7: Chuyển cột sang ống mới, bổ sung 500µl dung dịch Buffer 2, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 8: Lặp lại bước 7.
Bước 9: Làm khô bằng cách ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn cồn còn sót lại. Sau đó chuyển cột sang ống eppendorf 1,5ml mới.
Bước 10: Thêm 30µl dung dịch 3 vào cột để thôi DNA, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.
Bước 11: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút để thu DNA. (Có thể thôi DNA lần thứ 2 để đạt hiệu suất cao nhất).
Sau khi làm sạch, sản phẩm PCR được điện di để kiểm tra độ tinh khiết trên gel agarose 1%, đệm TAE 1X.
2.2.2.5. Phương pháp tách dòng gen tái tổ hợp (Cloning)
Để tách dòng và xác định trình tự gen, người ta thường sử dụng vectơ pCR TOPO 2.1 có kích thước 3,9 Kb.
Quá trình tách dòng bao gồm các bước cơ bản như sau: + Chọn và xử lý vectơ.
+ Gắn DNA cần tạo dòng vào vectơ (insert). + Tạo vectơ tái tổ hợp.
+ Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ (E. coli). + Sàng lọc và chọn dòng tế bào mang DNA tái tổ hợp.
Phản ứng lai DNA:
Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vectơ tách dòng pCR TOPO 2.1 nhờ T4 DNA ligase. Hỗn hợp phản ứng bao gồm các thành phần như sau:
Nước đề ion vô trùng 4,0 μl
Đệm T4 DNA ligase 1,0 μl
Sản phẩm PCR 2,5 μl
Vector pCR 2.1 (25mg/μl) 1,5 μl
T4 DNA ligase 1,0 μl
Cho các thành phần vào theo đúng trình tự trên, khuấy nhẹ, ủ ở 22oC qua