Để tách dòng và xác định trình tự gen, người ta thường sử dụng vectơ pCR TOPO 2.1 có kích thước 3,9 Kb.
Quá trình tách dòng bao gồm các bước cơ bản như sau: + Chọn và xử lý vectơ.
+ Gắn DNA cần tạo dòng vào vectơ (insert). + Tạo vectơ tái tổ hợp.
+ Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ (E. coli). + Sàng lọc và chọn dòng tế bào mang DNA tái tổ hợp.
Phản ứng lai DNA:
Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vectơ tách dòng pCR TOPO 2.1 nhờ T4 DNA ligase. Hỗn hợp phản ứng bao gồm các thành phần như sau:
Nước đề ion vô trùng 4,0 μl
Đệm T4 DNA ligase 1,0 μl
Sản phẩm PCR 2,5 μl
Vector pCR 2.1 (25mg/μl) 1,5 μl
T4 DNA ligase 1,0 μl
Cho các thành phần vào theo đúng trình tự trên, khuấy nhẹ, ủ ở 22oC qua đêm. Quy trình này thực hiện nhằm mục đích thu được vectơ tái tổ hợp đoạn gen cần tạo dòng.
Biến nạp vectơ tái tổ hợp bằng phương pháp sốc nhiệt
Bước 1: Cho 10 μl dịch vector pCR®2.1 đã gắn sản phẩm PCR vào ống chứa 50 μl tế bào khả biến Escherichia coli INVαF’, ủ trong đá 45 phút.
Bước 2: Sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút rồi chuyển ngay sang đá lạnh trong 2 phút.
Bước 3: Bổ sung 150 μl môi trường LB, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 1 giờ.
Bước 4: Cấy trải sản phẩm trên lên đĩa chứa môi trường chọn lọc (môi trường LB có bổ sung Kanamycine 50µg/ml và X-Gal 100µg/ml). Nuôi ở 37oC qua đêm.
Bước 5: Bảo quản ở 4oC để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
Trên môi trường LB có bổ sung X-gal, những khuẩn lạc có màu trắng là những dòng có thể được đính đoạn DNA ngoại lai, còn những khuẩn lạc màu xanh có thể là những cá thể không được đính đoạn DNA ngoại lai.
Kiểm tra chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp
Để chọn lọc dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen tái tổ hợp cần tách dòng, chọn khuẩn lạc trắng cấy vào ống chứa 5ml môi trường LB lỏng có bổ sung Kanamycin và X-gal, nuôi qua đêm ở 37oC có lắc, tiến hành tách chiết DNA plasmid.
Bước 1: Cho 1,5ml dịch nuôi cấy của dòng vi khuẩn được chọn vào eppendorf, ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút, đổ dịch thu sinh khối.
Bước 2: Thêm 250µl Buffer 1 (có bổ sung 25µl RNase A), vortex cho đến khi sinh khối tan hết.
Bước 3: Bổ sung 250µl Buffer 2 và đảo nhẹ 3 - 4 lần cho tới khi dịch trở nên trong.
Bước 4: Bổ sung 350µl Buffer 3 và đảo nhẹ 3 - 4 lần. Bước 5: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC.
Bước 6: Chuyển dịch sang ống gắn cột lọc DNA và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột sang eppendorf mới.
Bước 7: Thêm 700µl Buffer 4 (đã bổ sung ethanol) vào cột và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột sang eppendorf mới.
Bước 8: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hết ethanol. Bước 9: Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5ml.
Bước 10: Thêm 50 - 100µl Buffer 5 vào cột và để 1 phút ở nhiệt độ phòng. Bước 11: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ cột và giữ lại eppendorf chứa DNA plasmid.
Cắt kiểm tra DNA plasmid bằng EcoRI
Để khẳng định chắc chắn đoạn gen mong muốn có được gắn vào vectơ hay không cần cắt kiểm tra Plasmid thu được bằng EcoRI.
Phản ứng cắt EcoRI gồm những thành phần như sau:
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng cắt EcoRI Thành phần Thể tích (µl) H2O khử ion vô trùng 16 Đệm EcoRI 2 Enzyme EcoRI 1 Plasmid DNA 1 Tổng thể tích 20
Hỗn hợp được ủ ở 37oC trong 2 giờ, sau đó điện di kiểm tra.Theo lý thuyết khi plasmid tái tổ hợp cắt bằng EcoRI sẽ thu đuợc hai băng, một băng khoảng 3,9Kb là vectơ pCR TOPO 2.1, băng thứ hai khoảng 1500bp là đoạn gen cần tách dòng.
Plasmid sau khi tách được sử dụng để đọc trình tự trực tiếp. 2.2.2.6. Phương pháp giải trình tự gen
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc của phương pháp Sanger có sử dụng 4 loại deoxynucleotide và 4 loại dideoxynucleotide được đánh dấu huỳnh quang bằng 4 màu khác nhau. Nhờ hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA, enzyme này xúc tác gắn các nucleotide tự do vào mạch đơn của sợi DNA đang được tổng hợp ở vị trí 3’OH. Khi một dideoxynucleotide được gắn vào vị trí 3’OH của mạch đang tổng hợp, lúc này quá trình tổng hợp sẽ dừng lại do dideoxynucleotide không có oxy ở nhớm 3’OH để hình thành liên kết photphodieste với nucleotide tự do trong hỗn hợp phản ứng. Dựa trên tín hiệu màu nhận được, máy sẽ tự động ghi lại và chuyển tín hiệu màu thành trình tự nucleotide tương ứng.
Kết quả giải trình tự được xử lý bằng máy ABI PRISM® 3100 – Avant Data Collection v1.0, các phần mềm: DNA Sequencing Analysis, Chromas. Sau đó, trình tự được phân tích bằng phần mềm GeneDoc, Mega6, và được đăng ký trên ngân hàng genome NCBI.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả phân lập và xác định P. aeruginosa bằng phương pháp vi sinh vật
3.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn P. aeruginosa trên môi trường King A
Các chủng vi khuẩn được phân lập trên môi trường King A, sau khi nuôi cấy ở 30oC trong 24 giờ, quan sát trên đĩa thạch thấy xuất hiện các khuẩn lạc có kích thước và màu sắc khác nhau: vàng, xanh.
Hình 3.1: Phân lập P. aeruginosa trên King A
Từ đó chúng tôi lựa chọn các khuẩn lạc màu xanh rồi tuyển chọn vài lần trên môi trường King A nhằm thu được các khuẩn lạc thuần nhất. Các chủng vi khuẩn được phân lập có kí hiệu như sau: PS5, PS8, PS9, PS10, PS11, PS12, PS39, PS40, PS41, PS42, PS43. Màu sắc khuẩn lạc tương ứng với chủng vi khuẩn có hoặc không sinh sắc tố trên môi trường King A. Vì P. aeruginosa là loài sinh sắc tố xanh trên môi trường King A nên chúng sẽ tạo khuẩn lạc xanh và làm biến màu môi trường King A thành màu xanh.
Hình 3.2: Một số chủng vi khuẩn phân lập được trên môi trường King A
3.1.2 Kết quả nhuộm Gram
Các chủng P. aeruginosa được xác định tính chất Gram bằng phương pháp nhuộm Gram. Từ dịch làm giàu vi khuẩn trên môi trường NB lỏng, lấy 1ml dung dịch cho vào ống eppendorf đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa, hòa tủa trong nước sinh lý (0,9% NaCl). Sau đó hút 10µl đem đi nhuộm Gram. Sau khi tiến hành nhuộm Gram 11 chủng vi khuẩn và quan sát dưới kính hiển vi quang học với vật kính dầu có độ phóng đại 1000 lần, chúng tôi đều thu được kết quả là vi khuẩn Gram âm và dưới đây là hình ảnh đại diện của chủng PS39.
Màu của tế bào vi khuẩn nhận được sau khi nhuộm với các thuốc nhuộm tím kết tinh và iot được sử dụng như một trong nhiều đặc điểm quan trọng để bước đầu phân loại vi khuẩn. Các vi khuẩn Gram dương sẽ có màu lam, còn các tế bào vi khuẩn Gram âm sẽ có màu hồng do bắt màu thuốc nhuộm bổ sung safranin sau khi phức chất tím kết tinh và iot bị rửa trôi bởi ethanol. Từ hình trên chúng tôi nhận thấy tế bào của những chủng vi khuẩn chúng tôi phân lập được bắt màu hồng, như vậy chúng đều là vi khuẩn thuộc loại Gram âm.
3.1.3. Kết quả nghiên cứu hoạt tính enzyme
Chúng tôi đã tiến hành xác định các hoạt tính enzyme: amylase, protease và lipase của 11 chủng vi khuẩn phân lập được. Cách thực hiện theo mô tả ở phần phương pháp nghiên cứu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra hoạt tính enzym trên đĩa thạch TT Tên chủng Amylase Protease Gelatinase Lipase
1 PS5 - +++ +++ + 2 PS8 - +++ +++ + 3 PS9 - +++ +++ + 4 PS10 - +++ +++ + 5 PS11 - +++ +++ + 6 PS12 - - + + 7 PS39 - +++ +++ + 8 PS40 - - + - 9 PS41 - +++ +++ + 10 PS42 - +++ +++ + 11 PS43 - - + -
Trên bảng, tất cả các chủng đều có hoạt tính gelatinase, 72,7% chủng có hoạt tính protease (8/11 chủng) và hai hoạt tính này biểu hiện rất cao, 81,8% chủng có hoạt tính lipase (9/11 chủng), hoạt tính này biểu hiện yếu, không có chủng nào có hoạt tính amylase. Có 3 chủng là PS12, PS40 và PS41 không thể hiện hoạt tính enzyme protease và thể hiện hoạt tính enzyme gelatinase yếu. Chủng PS40 và PS41 không có hoạt tính enzyme Lipase.
3.1.4. Kết quả thử hoạt tính kháng kháng sinh
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được. Các chủng vi khuẩn được cấy trải lên đĩa môi trường NB thạch, sau đó đặt các khoanh kháng sinh lên đĩa và ủ ở 30oC qua đêm. Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn được thể hiện bằng đường kính vòng vô khuẩn(D- d, mm); trong đó D là đường kính vòng vô khuẩn, d là đường kính khoanh giấy. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng3.2: Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của các chủng PS
STT Tên mẫu Kháng sinh Tetracyclin (TE) Ampicillin (AM) Penicillin (PG) Kanamicin (KM) Gentamicin (GM) Microcin 1 PS5 R R R R R R 2 PS8 R R R R R R 3 PS9 R R R R R R 4 PS10 R R R R R R 5 PS11 R R R R R R 6 PS12 R R R R R R 7 PS39 R R R R R R 8 PS40 R R R R R R 9 PS41 R R R R R R 10 PS42 R R R R R R 11 PS43 R R R R R R
Ghi chú: R – Resistante (đề kháng)
Kết quả trên cho thấy là 100% chủng vi khuẩn đa kháng kháng sinh với các loại thuốc kháng sinh như: Tetracyclin, Ampicilin, Penicilin, Kanamicin, Gentamicin và Microcin. Có nhiều công bố về tính kháng kháng sinh của chủng
Pseudomonas aeruginosa cho thấy chúng kháng hầu hết các kháng sinh nhóm Beta-lactam. Nghiên cứu tính kháng kháng sinh của chủng P. aeruginosa ở bệnh
viện trong 3 năm 2006-2008 cho kết quả trong tổng số 348 chủng phân lập thì 100% kháng với 8 loại kháng sinh : ampicillin, cefzolin, tetracyclin, doxycycline, nitroffurantoin, nalidixic acit và trimetroprin. Chỉ một số ít kháng sinh có hiệu quả như gentamicin, amikacin [9]. Theo nghiên cứu của tác giả Akingbade về khả năng kháng thuốc của 110 chủng P. aeruginosa được thu thập từ vết thương lâm sàng ở ba bệnh viện ở phía Tây Nam, Nigeria thì P aeruginosa có khả năng kháng cao với amoxicillin (92,7%), ampicillin (90%), cloxacillin (88,2%), cotrimoxazole (77,3%), erythromycin (72,7%), tetracycline (70,9%), streptomycin (65,5%), ofloxacin (60%) và có khả năng mẫn cảm với ceftazidime (20%), gentamycin (26,4%), levoxin (30,9%), ceftriaxone (34,5%) và ciprofloxacin (35,5%) [10]. 3.2. Kết quả xác định P. aeruginosa bằng phương pháp sinh học phân tử
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Các chủng vi khuẩn phân lập được làm giàu trên môi trường NB lỏng ở 30oC trong 24 giờ. Lấy 1,5ml dịch làm giàu đó và tách DNA. Chế phẩm DNA được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, đệm TAE 1X và nhuộm ethidium bromide. Kết quả được trình bày ở hình 3.4.
Trên ảnh điện di, chúng tôi nhận thấy DNA tổng số của các chủng vi khuẩn chỉ có một băng DNA đậm, không bị đứt gãy và RNA đã được loại hoàn toàn, điều đó có nghĩa rằng chế phẩm DNA là sạch và đảm bảo cho việc thực hiện PCR dựa trên khuôn DNA này.
Hình 3.4: Ảnh điện di DNA tổng số của các chủng vi khuẩn phân lập được
M: Marker DNA 1kb
1-10: DNA tổng số của PS5; PS8; PS9; PS10; PS11; PS12; PS39; PS40; PS41, PS42
3.2.2. Kết quả PCR gen đặc hiệu P. aeruginosa (PA):
Sản phẩm DNA tổng số được sử dụng làm khuôn để khuếch đại đoạn gen PA ở các chủng vi khuẩn nghiên cứu. Chúng tôi đã sử dụng cặp mồi PA-F và PA-R có trình tự như sau:
PA-F: 5’- GGGGGATCTTCGGACCTCA - 3’ PA-R: 5’ - TCCTTAGAGTGCCCACCCG - 3’
Cặp mồi trên có độ đặc hiệu và độ nhạy 100% với chủng P. aeruginosa,
chúng tôi sử dụng chúng để khuếch đại đoạn gen PA với chiều dài mong muốn là 956bp [85]. Thành phần và chương trình phản ứng được thực hiện theo mô tả ở phần phương pháp nghiên cứu. Phản ứng được thực hiện trên máy PCR (GeneAmpR PCR System 9700, Mỹ). Chúng tôi cũng đồng thời tiến hành phản ứng PCR trên với sản phẩm DNA tổng số của vi khuẩn Edwrdseilla Ictaluri (EI) để kiểm chứng độ đặc hiệu của cặp mồi được sử dụng. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, đệm TAE 1X, nhuộm ethidium bromide. Kết quả được trình bày trên hình 3.5.
Hình 3.5: Sản phẩm PCR đoạn gen 956 bp đặc hiệu cho PA
M:Marker 1kp , giếng1: chứng âm , giếng 2: DNA EI, 3-11: các chủng PS5; PS8;PS9;PS10;PS11;PS12; PS39;PS41; PS42
Trên ảnh điện di, đoạn gen PA là một băng DNA rõ nét với độ dài khoảng 956bp (đúng theo tính toán lý thuyết) được thấy trên gel agarose. Cả 11 chủng phân lập được cho kết quả dương tính, chủng vi khuẩn Edwrdseilla Ictaluri cho kết quả âm tính. Qua đó có thể khẳng định rằng cặp mồi được sử dụng rất đặc hiệu, chương trình phản ứng rất phù hợp cho cặp mồi trên và kết quả nhận được hoàn toàn chính xác.
Như vậy, gen PA là gen đặc trưng loài và được coi là chỉ thị phân tử để phát hiện P. aeruginosa.
3.2.3. Kết quả PCR gen 16s rRNA
Chúng tôi chọn 2 chủng PS5 và PS39 làm hai chủng đại diện, sản phẩm DNA tổng số của chúng được sử dụng để làm khuôn cho phản ứng PCR đoạn gen 16SrRNA với cặp mồi 27f và 1525r gen 16s rRNAcó trình tự như sau:
27f: 5’ –CGGTTACCTTGTTACGACTT – 3’ 1525r: 5’ –AGGAGGTGATCCAGCC – 3’
Chúng tôi sử dụng cặp mồi trên để khuếch đại đoạn gen 16s rRNA. Thành phần và chương trình phản ứng được thực hiện theo mô tả ở phần phương pháp
nghiên cứu. Phản ứng được thực hiện trên máy PCR (GeneAmpR PCR System 9700, Mỹ). Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, đệm TAE 1X, nhuộm ethidium bromide. Kết quả được trình bày trên hình 3.6.
Hình 3.6: Sản phẩm PCR gen 16s rRNA
M:Marker 1kb; giếng 1 - PS5;2-PS39; N – chứng âm
Trên ảnh điện di, đoạn gen 16s rRNA là một băng rõ nét với độ dài khoảng 1500bp (đúng với tính toán lý thuyết) trên gel agarose. Cả 2 chủng PS5 và PS39 đều cho kết quả dương tính với cặp mồi sử dụng. Sản phẩm PCR trên được chúng tôi sử dụng để làm sạch, tách dòng và giải trình tự.
3.2.4. Kết quả tách dòng tái tổ hợp mang đoạn gen 16s rRNA
Chúng tôi lựa chọn chủng PS39 để tiến hành tách dòng tái tổ hợp mang đoạn gen 16s rRNA. Sản phẩm PCR (đoạn gen 16s rRNA) của chủng PS39 sau khi được làm sạch được gắn vào vectơ tách dòng pCR TOPO 2.1 đã mở vòng, thành phần phản ứng và các bước tiến hành được thực hiện theo mô tả ở phần phương pháp nghiên cứu. Sau đó, vectơ tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Sau khi biến nạp, các thể biến nạp được cấy trải trên môi trường chọn lọc chứa Kanamycin, chất cảm ứng IPTG và chất chỉ thị màu X-gal. Trên môi trường chọn lọc này, theo lý thuyết thì các khuẩn lạc E. coli mang vectơ
tái tổ hợp sẽ có màu trắng trong khi đó các khuẩn lạc mang vectơ pCR TOPO 2.1 không được gắn đoạn DNA ngoại lai sẽ có màu xanh. Kết quả biến nạp như hình 3.7.
Hình 3.7: Màu sắc khuẩn lạc sau khi biến nạp
Tất cả các khuẩn lạc phát triển được trên môi trường có Kanamycine đều là chủng E.coli mang plasmid. Những khuẩn lạc xanh xuất hiện là do vectơ pCR
TOPO 2.1 mang lac operon hoạt động bình thường, khi có chất cảm ứng IPTG, operon sẽ tổng hợp enzyme β-galactosidaza. Enzyme này chuyển hoá cơ chất X- gal thành hợp chất có màu xanh. Khuẩn lạc có màu trắng có thể là do mang plasmid có lac operon không hoạt động. Lac operon bị bất hoạt là do nó bị thay đổi cấu trúc, bị đứt đoạn hay bị thay đổi trình tự hoặc có thể do đoạn DNA ngoại lai gắn vào giữa vùng promotor của operon và gen cấu trúc lac Z. Trong trường hợp này, lac promotor không thể điều khiển gen cấu trúc phiên mã nên không có sự dịch mã thành enzyme. Chính vì vậy, khi có mặt của chất cảm ứng IPTG enzyme β- galactosidaza vẫn không được tổng hợp. Tuy nhiên, không phải tất cả các khuẩn