Chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được. Các chủng vi khuẩn được cấy trải lên đĩa môi trường NB thạch, sau đó đặt các khoanh kháng sinh lên đĩa và ủ ở 30oC qua đêm. Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn được thể hiện bằng đường kính vòng vô khuẩn(D- d, mm); trong đó D là đường kính vòng vô khuẩn, d là đường kính khoanh giấy. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng3.2: Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của các chủng PS
STT Tên mẫu Kháng sinh Tetracyclin (TE) Ampicillin (AM) Penicillin (PG) Kanamicin (KM) Gentamicin (GM) Microcin 1 PS5 R R R R R R 2 PS8 R R R R R R 3 PS9 R R R R R R 4 PS10 R R R R R R 5 PS11 R R R R R R 6 PS12 R R R R R R 7 PS39 R R R R R R 8 PS40 R R R R R R 9 PS41 R R R R R R 10 PS42 R R R R R R 11 PS43 R R R R R R
Ghi chú: R – Resistante (đề kháng)
Kết quả trên cho thấy là 100% chủng vi khuẩn đa kháng kháng sinh với các loại thuốc kháng sinh như: Tetracyclin, Ampicilin, Penicilin, Kanamicin, Gentamicin và Microcin. Có nhiều công bố về tính kháng kháng sinh của chủng
Pseudomonas aeruginosa cho thấy chúng kháng hầu hết các kháng sinh nhóm Beta-lactam. Nghiên cứu tính kháng kháng sinh của chủng P. aeruginosa ở bệnh
viện trong 3 năm 2006-2008 cho kết quả trong tổng số 348 chủng phân lập thì 100% kháng với 8 loại kháng sinh : ampicillin, cefzolin, tetracyclin, doxycycline, nitroffurantoin, nalidixic acit và trimetroprin. Chỉ một số ít kháng sinh có hiệu quả như gentamicin, amikacin [9]. Theo nghiên cứu của tác giả Akingbade về khả năng kháng thuốc của 110 chủng P. aeruginosa được thu thập từ vết thương lâm sàng ở ba bệnh viện ở phía Tây Nam, Nigeria thì P aeruginosa có khả năng kháng cao với amoxicillin (92,7%), ampicillin (90%), cloxacillin (88,2%), cotrimoxazole (77,3%), erythromycin (72,7%), tetracycline (70,9%), streptomycin (65,5%), ofloxacin (60%) và có khả năng mẫn cảm với ceftazidime (20%), gentamycin (26,4%), levoxin (30,9%), ceftriaxone (34,5%) và ciprofloxacin (35,5%) [10]. 3.2. Kết quả xác định P. aeruginosa bằng phương pháp sinh học phân tử
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Các chủng vi khuẩn phân lập được làm giàu trên môi trường NB lỏng ở 30oC trong 24 giờ. Lấy 1,5ml dịch làm giàu đó và tách DNA. Chế phẩm DNA được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, đệm TAE 1X và nhuộm ethidium bromide. Kết quả được trình bày ở hình 3.4.
Trên ảnh điện di, chúng tôi nhận thấy DNA tổng số của các chủng vi khuẩn chỉ có một băng DNA đậm, không bị đứt gãy và RNA đã được loại hoàn toàn, điều đó có nghĩa rằng chế phẩm DNA là sạch và đảm bảo cho việc thực hiện PCR dựa trên khuôn DNA này.
Hình 3.4: Ảnh điện di DNA tổng số của các chủng vi khuẩn phân lập được
M: Marker DNA 1kb
1-10: DNA tổng số của PS5; PS8; PS9; PS10; PS11; PS12; PS39; PS40; PS41, PS42
3.2.2. Kết quả PCR gen đặc hiệu P. aeruginosa (PA):
Sản phẩm DNA tổng số được sử dụng làm khuôn để khuếch đại đoạn gen PA ở các chủng vi khuẩn nghiên cứu. Chúng tôi đã sử dụng cặp mồi PA-F và PA-R có trình tự như sau:
PA-F: 5’- GGGGGATCTTCGGACCTCA - 3’ PA-R: 5’ - TCCTTAGAGTGCCCACCCG - 3’
Cặp mồi trên có độ đặc hiệu và độ nhạy 100% với chủng P. aeruginosa,
chúng tôi sử dụng chúng để khuếch đại đoạn gen PA với chiều dài mong muốn là 956bp [85]. Thành phần và chương trình phản ứng được thực hiện theo mô tả ở phần phương pháp nghiên cứu. Phản ứng được thực hiện trên máy PCR (GeneAmpR PCR System 9700, Mỹ). Chúng tôi cũng đồng thời tiến hành phản ứng PCR trên với sản phẩm DNA tổng số của vi khuẩn Edwrdseilla Ictaluri (EI) để kiểm chứng độ đặc hiệu của cặp mồi được sử dụng. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, đệm TAE 1X, nhuộm ethidium bromide. Kết quả được trình bày trên hình 3.5.
Hình 3.5: Sản phẩm PCR đoạn gen 956 bp đặc hiệu cho PA
M:Marker 1kp , giếng1: chứng âm , giếng 2: DNA EI, 3-11: các chủng PS5; PS8;PS9;PS10;PS11;PS12; PS39;PS41; PS42
Trên ảnh điện di, đoạn gen PA là một băng DNA rõ nét với độ dài khoảng 956bp (đúng theo tính toán lý thuyết) được thấy trên gel agarose. Cả 11 chủng phân lập được cho kết quả dương tính, chủng vi khuẩn Edwrdseilla Ictaluri cho kết quả âm tính. Qua đó có thể khẳng định rằng cặp mồi được sử dụng rất đặc hiệu, chương trình phản ứng rất phù hợp cho cặp mồi trên và kết quả nhận được hoàn toàn chính xác.
Như vậy, gen PA là gen đặc trưng loài và được coi là chỉ thị phân tử để phát hiện P. aeruginosa.
3.2.3. Kết quả PCR gen 16s rRNA
Chúng tôi chọn 2 chủng PS5 và PS39 làm hai chủng đại diện, sản phẩm DNA tổng số của chúng được sử dụng để làm khuôn cho phản ứng PCR đoạn gen 16SrRNA với cặp mồi 27f và 1525r gen 16s rRNAcó trình tự như sau:
27f: 5’ –CGGTTACCTTGTTACGACTT – 3’ 1525r: 5’ –AGGAGGTGATCCAGCC – 3’
Chúng tôi sử dụng cặp mồi trên để khuếch đại đoạn gen 16s rRNA. Thành phần và chương trình phản ứng được thực hiện theo mô tả ở phần phương pháp
nghiên cứu. Phản ứng được thực hiện trên máy PCR (GeneAmpR PCR System 9700, Mỹ). Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, đệm TAE 1X, nhuộm ethidium bromide. Kết quả được trình bày trên hình 3.6.
Hình 3.6: Sản phẩm PCR gen 16s rRNA
M:Marker 1kb; giếng 1 - PS5;2-PS39; N – chứng âm
Trên ảnh điện di, đoạn gen 16s rRNA là một băng rõ nét với độ dài khoảng 1500bp (đúng với tính toán lý thuyết) trên gel agarose. Cả 2 chủng PS5 và PS39 đều cho kết quả dương tính với cặp mồi sử dụng. Sản phẩm PCR trên được chúng tôi sử dụng để làm sạch, tách dòng và giải trình tự.
3.2.4. Kết quả tách dòng tái tổ hợp mang đoạn gen 16s rRNA
Chúng tôi lựa chọn chủng PS39 để tiến hành tách dòng tái tổ hợp mang đoạn gen 16s rRNA. Sản phẩm PCR (đoạn gen 16s rRNA) của chủng PS39 sau khi được làm sạch được gắn vào vectơ tách dòng pCR TOPO 2.1 đã mở vòng, thành phần phản ứng và các bước tiến hành được thực hiện theo mô tả ở phần phương pháp nghiên cứu. Sau đó, vectơ tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Sau khi biến nạp, các thể biến nạp được cấy trải trên môi trường chọn lọc chứa Kanamycin, chất cảm ứng IPTG và chất chỉ thị màu X-gal. Trên môi trường chọn lọc này, theo lý thuyết thì các khuẩn lạc E. coli mang vectơ
tái tổ hợp sẽ có màu trắng trong khi đó các khuẩn lạc mang vectơ pCR TOPO 2.1 không được gắn đoạn DNA ngoại lai sẽ có màu xanh. Kết quả biến nạp như hình 3.7.
Hình 3.7: Màu sắc khuẩn lạc sau khi biến nạp
Tất cả các khuẩn lạc phát triển được trên môi trường có Kanamycine đều là chủng E.coli mang plasmid. Những khuẩn lạc xanh xuất hiện là do vectơ pCR
TOPO 2.1 mang lac operon hoạt động bình thường, khi có chất cảm ứng IPTG, operon sẽ tổng hợp enzyme β-galactosidaza. Enzyme này chuyển hoá cơ chất X- gal thành hợp chất có màu xanh. Khuẩn lạc có màu trắng có thể là do mang plasmid có lac operon không hoạt động. Lac operon bị bất hoạt là do nó bị thay đổi cấu trúc, bị đứt đoạn hay bị thay đổi trình tự hoặc có thể do đoạn DNA ngoại lai gắn vào giữa vùng promotor của operon và gen cấu trúc lac Z. Trong trường hợp này, lac promotor không thể điều khiển gen cấu trúc phiên mã nên không có sự dịch mã thành enzyme. Chính vì vậy, khi có mặt của chất cảm ứng IPTG enzyme β- galactosidaza vẫn không được tổng hợp. Tuy nhiên, không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều mang plasmid tái tổ hợp. Mặc dù vậy, việc chọn các khuẩn lạc trắng để tách chiết các plasmid đã loại bỏ được phần lớn các trường hợp không mong muốn.
* Kiểm tra chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp.
Để chọn lọc dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen 16s rRNA cần tách dòng, chúng tôi chọn ba khuẩn lạc trắng cấy vào ba ống, mỗi ống chứa 5ml môi trường LB lỏng có bổ sung Kanamycine và X-gal, nuôi qua đêm ở 37oC có lắc, sau đó tiến hành tách chiết DNA plasmid và cắt kiểm tra bằng EcoRI, các bước tiến hành và thành phần phản ứng được thực hiện theo mô tả ở phần phương pháp. Sản phẩm cuối cùng được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, đệm TAE 1X, nhuộm ethidium bromide. Kết quả được trình bày trên hình 3.8.
M 1 2 3
Hình 3.8: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm cắt của các DNA plasmid
M: Marker 1kb
1,2,3: Sản phẩm cắt DNA của khuẩn lạc số 1, 2, 3
Kết quả trên điện di đồ cho thấy mẫu 1 và 3 gồm 2 băng: băng 1500bp đúng với kích thước đoạn gen chuyển nạp và vectơ pCR TOPO 2.1 với kích thước 3,9Kb. Mẫu 2 chỉ có một băng của vectơ pCR TOPO 2.1 với kích thước 3,9Kb chứng tỏ đoạn gen 16s rRNA chưa gắn được vào vectơ tách dòng pCR TOPO 2.1.
Như vậy đoạn gen 16s rRNA đã được tạo dòng thành công ở khuẩn lạc số 1 và 3. Chúng tôi đã lựa chọn khuẩn lạc số 1 để tinh sạch và xác định trình tự gen.
Plasmid tái tổ hợp từ khuẩn lạc 1 được chọn để tinh sạch và xác định trình tự gen. Nồng độ của plasmid được đo bằng quang phổ kế. Sau khi đã tính toán được nồng độ, 10µg DNA được gửi đi đọc trình tự. Quá trình giải trình tự được thực hiện bằng máy tự động ABI 3000 với phần mềm Sequencing Analysis. Trình tự chủng PS39 sau khi xử lý trình tự có kết quả như sau:
1 AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG ATTGAACGCT GGCGGCAGGC CTAACACATG CAAGTCGAGC 61 GGATGAAGGG AGCTTGCTCC TGGATTCAGC GGCGGACGGG TGAGTAATGC CTAGGAATCT 121 GCCTGGTAGT GGGGGATAAC GTCCGGAAAC GGGCGCTAAT ACCGCATACG TCCTGAGGGA 181 GAAAGTGGGG GATCTTCGGA CCTCACGCTA TCAGATGAGC CTAGGTCGGA TTAGCTAGTT 241 GGTGGGGTAA AGGCCTACCA AGGCGACGAT CCGTAACTGG TCTGAGAGGA TGATCAGTCA 301 CACTGGAACT GAGACACGGT CCAGACTCCT ACGGGGGGCA GCAGTGGGGA ATATTGGACA 361 ATGGGCGAAA GCCTGATCCA GCCATGCCGC GTGTGTGAAG AAGGTCTTCG GATTGTAAAG 421 CACTTTAAGT TGGGAGGAAG GGCAGTAAGT TAATACCTTG CTGTTTTGAC GTTACCAACA 481 GAATAAGCAC CGGCTAACTT CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGAAGGGT GCAAGCGTTA 541 ATCGGAATTA CTGGGCGTAA AGCGCGCGTA GGTGGTTCAG CAAGTTGGAT GTGAAATCCC 601 CGGGCTCAAC CTGGGAACTG CATCCAAAAC TACTGAGCTA GAGTACGGTA GAGGGTGGTG 661 GAATTTCCTG TGTAGCGGTG AAATGCGTAG ATATAGGAAG GAACACCAGT GGCGAAGGCG 721 ACCACCTGGA CTGATACTGA CACTGAGGTG CGAAAGCGTG GGGAGCAAAC AGGATTAGAT 781 ACCCTGGTAG TCCACGCCGT AAACGATGTC GACTAGCCGT TGGGATCCTT GAGATCTTAG 841 TGGCGCAGCT AACGCGATAA GTCGACCGCC TGGGGAGTAC GGCCGCAAGG TTAAAACTCA 901 AATGAATTGA CGGGGGCCCG CACAAGCGGT GGAGCATGTG GTTTAATTCG AAGCAACGCG 961 AAGAACCTTA CCTGGCCTTG ACATGCTGAG AACTTTCCAG AGATGGATTG GTGCCTTCGG 1021 GAGCTCAGAC ACAGGTGCTG CATGGCTGTC GTCAGCTCGT GCCGTGAGAT GTTGGGTTAA 1081 GTCCCGTAAC GAGCGCAACC CTTGTCCTTA GTTACCAGCA CCTCGGGTGG GCACTCTAAG 1141 GAGACTGCCG GTGACAAACC GGAGGAAGGT GGGGATGACG TCAAGTCATC ATGGCCCTTA 1201 CGGCCAGGGC TACACACGTG CTACAATGGT CGGTACAAAG GGTTGCCAAG CCGCGAGGTG 1261 GAGCTAATCC CATAAAACCG ATCGTAGTCC GGATCGCAGT CTGCAACTCG ACTGCGTGAA 1321 GTCGGAATCG CTAGTAATCG TGAATCAGAA TGTCACGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT 1381 ACACACCGCC CGTCACACCA TGGGAGTGGG TTGCTCCAGA AGTAGCTAGT CTAACCGCAA 1441 GGGGGACGGT TACCACGGAG TGATTCATGA CTGGGGTGAA GTCGTAACAA GGTAGCCGTA 1501 GGGGAACCTG CGGCTGGATC ACCTCCTTA
Trình tự chủng PS39 sau khi xử lý trình tự có kích thước 1529 bp, đúng với tính toán lý thuyết. Trình tự đã được đăng ký trên ngân hàng Gen Quốc tế với mã số KJ579953. So sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng PS39 với các trình tự gen của các vi sinh vật trên ngân hàng gen thế giới và phân tích bằng phần mềm GeneDoc và Mega6, độ tương đồng giữa chủng PS39 với một số chủng vi sinh vật khác được xác định bằng bảng dưới đây.
Bảng 3.3: Mức độ tương đồng đoạn gen 16s rRNA của chủng PS39 với một số chủng vi khuẩn trên ngân hàng gen thế giới.
TT Số đăng kí
NCBI
Tên chủng Chiều dài
(bp)
Quốc gia Độ tương
đồng (%)
1 EF432565 Pseudomonas aeruginosa
SH6 1528 China >99 2 JF708186 Pseudomonas aeruginosa MGP3 1568 China >99 3 JQ249910 Pseudomonas aeruginosa ZDC-2 1530 China >99
4 AF125317 Pseudomonas sp. pDL01 1531 USA >99 5 NR_07482 8 Pseudomonas aeruginosa PAO1 1536 >99 6 JN003625 Pseudomonas aeruginosa strain BS8 1541 India >99 7 GQ180117 Pseudomonas aeruginosa strain MW3A 1528 Malaysia >99 8 HQ288928 Pseudomonas aeruginosa G14 1529 Netherlan ds >99
Mức độ tương đồng của chủng PS39 với các chủng vi khuẩn khác trên ngân hàng gen cho thấy chủng PS39 có độ tương đồng trên 99% với cả 9 chủng vi khuẩn được đem so sánh.
Dựa trên kết quả mức độ tương đồng đoạn gen 16s rRNA của chủng PS39 với các chủng vi khuẩn khác trên ngân hàng gen thế giới, cây phát sinh chủng loại đã được xây dựng như hình.
Hình 3.9: Cây phát sinh chủng loài của chủng PS39
Từ vị trí của chủng PS39 trên cây phát sinh loài cho thấy chủng này gần gũi với các chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas, loài Pseudomonas aeruginosa.
Trình từ gen 16s rRNA của chủng PS39 có mức tương đồng 99% với các vi khuẩn
P. aeruginosa SH6,P. aeruginosa MGP3, P. aeruginosa ZDC-2, Pseudomonas sp.
pDL01, P. aeruginosa PAO1, P. aeruginosa strain BS8, P. aeruginosa strain MW3A, P. aeruginosa G14, Pseudomonas sp. NR2. Kết hợp với một số đặc điểm hình thái và trình tự đoạn gen 16s rRNA của chủng vi khuẩn PS30, chủng vi khuẩn này có thể được xếp vào loài Pseudomonas aeruginosa và được đặt tên là
Pseudomonas aeruginosa PS39. Chủng PS39 được chúng tôi sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3. Kết quả nghiên cứu khả năng sinh hoạt chất kháng Vibrio sp của
P.aeruginosa PS39
Chủng PS39 giống phân lập từ nước nuôi thủy sản, có đặc tính và trình tự 16SrRNA ( mã số KJ579953) được xác định là P. aeruginosa, tiết hoạt chất có sắc tố xanh ở môi trường King A và tan trong chloroform. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng PS 39 trên môi trường King A, thu dịch nuôi và tách chiết bằng chloroform. Quá trình tách chiết được mô tả ở phần phương pháp.
a b c Hình 3.10: Chủng Pseudomonas aeruginosa PS 39 và hoạt chất PCN
a: PS39 trên môi trường King A; b: Dịch nuôi vi khuẩn PS trên King A c, Dịch chiết chloroform của PS39
Các chủng vi khuẩn sử dụng để thử nghiệm là các chủng Vibrio sp phân lập từ tôm sú và tôm chân trắng bệnh, tôm hùm đỏ thân, trong bộ mẫu của Viện CNSH và các chủng ATCC đã kháng với một số loại kháng sinh thường dùng trong nuôi thủy sản.
3.3.1. Kết quả xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối vi khuẩn và nồng độ hoạt chất. khuẩn và nồng độ hoạt chất.
Sử dụng chủng PS39 nuôi trong 20 ml môi trường king A ở 30oC, lắc 200 vòng/phút. Sau thời gian: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ngày tiến hành thu sinh khối và xác định mật độ vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (mô tả ở phần phương pháp) để xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối vi khuẩn. Kết quả xác định nồng độ được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối vi khuẩn
TT Thời gian (ngày) Mật độ vi khuẩn (CFU/ml) 1 1 2,13 x108±0,31 2 2 5,2 x108±0,72 3 3 1,05 x109±0,10 4 4 1,57x109±0,10 5 5 1,64 x109±0,15 6 6 2,13x109±0,06 7 7 2,33x109±0,06 8 8 1,27x109±0,25
Từ kết quả trên chúng tôi nhận thấy mật độ vi khuẩn PS39 tăng dần theo thời gian và đạt tối đa sau 7 ngày nuôi cấy là 2,33.109±0,06 CFU/ml; đến ngày thứ 8 mật độ vi khuẩn giảm xuống 1,27.109±0,25 CFU/ml. Như vậy chủng P. aeruginosa PS39 đạt sinh khối cao nhất sau 7 ngày nuôi cấy.
b, Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến nồng độ hoạt chất:
Xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi lên nồng độ pyocyanin như sau: vi khuẩn PS39 nuôi trong 20 ml môi trường king A ở 30oC lắc 200 vòng/phút. Sau thời gian 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8 ngày lần lượt thu mẫu và xác định nồng độ pyocyanin (theo phương pháp mô tả ở phân phương pháp nghiên cứu). Kết quả được trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5: Sự phụ thuộc nồng độ pyocyanin vào thời gian nuôi vi khuẩn TT Thời gian (ngày) Nồng độ pyocyanin (µg/ml)
1 1 9,96 2 2 17,02 3 3 20,60 4 4 28,26 5 5 42,33 6 6 47,80 7 7 60,26 8 8 56,20
Từ kết quả trên chúng tôi nhận thấy nồng độ hoạt chất tăng dần theo thời gian nuôi cấy và đạt nồng độ tối đa là 60,26(±2,04)µg/ml sau 7 ngày nuôi cấy. Đến ngày thứ 8, nồng độ hoạt chất tiết ra môi trường giảm xuống còn 56,34(±1,79)µg/ml. Như vậy nồng độ hoạt chất của chủng PS39 đạt cao nhất sau 7
ngày nuôi cấy. Hiệu suất tạo pyocyanin của chủng PS39 tương đương các chủng công bố của tác giả Mohamed M. Gharieb (2013) khi nuôi cấy chủng P. aeruginosa, nồng độ PCN đạt tối đa là 64.90 µg/ml sau 5 ngày [63].
Biểu đồ 3.2: Nồng độ hoạt chất theo thời gian
3.3.2. Kết quả xác định khả năng kháng Vibrio của dịch nuôi vi khuẩn và hoạt chất PCN chất PCN
Dịch nuôi và dịch chiết vi khuẩn thu được sau khi nuôi cấy P. aeruginosa
PS39 trên môi trường King A được kiểm tra khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch.
Nuôi cấy chủng V. parahaemolyticus, V. alginolyticus trên môi trường APW
lắc ở 30oC trong vòng 20-24 giờ. Đo OD ở bước sóng 600nm xác định mật độ vi khuẩn, sau đo pha loãng đến nồng độ 107 vi khuẩn/ml. Hút 0,1ml huyền dịch vi khuẩn nồng độ 107 vi khuẩn /ml cấy trải lên đĩa thạch 2216E, để khô rồi đặt lên các đĩa thạch các khoanh giấy đã có sẵn dịch nuôi vi khuẩn và dịch chiết bằng