Sản phẩm DNA tổng số được sử dụng làm khuôn để khuếch đại đoạn gen PA ở các chủng vi khuẩn nghiên cứu. Chúng tôi đã sử dụng cặp mồi PA-F và PA-R có trình tự như sau:
PA-F: 5’- GGGGGATCTTCGGACCTCA - 3’ PA-R: 5’ - TCCTTAGAGTGCCCACCCG - 3’
Cặp mồi trên có độ đặc hiệu và độ nhạy 100% với chủng P. aeruginosa,
chúng tôi sử dụng chúng để khuếch đại đoạn gen PA với chiều dài mong muốn là 956bp [85]. Thành phần và chương trình phản ứng được thực hiện theo mô tả ở phần phương pháp nghiên cứu. Phản ứng được thực hiện trên máy PCR (GeneAmpR PCR System 9700, Mỹ). Chúng tôi cũng đồng thời tiến hành phản ứng PCR trên với sản phẩm DNA tổng số của vi khuẩn Edwrdseilla Ictaluri (EI) để kiểm chứng độ đặc hiệu của cặp mồi được sử dụng. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, đệm TAE 1X, nhuộm ethidium bromide. Kết quả được trình bày trên hình 3.5.
Hình 3.5: Sản phẩm PCR đoạn gen 956 bp đặc hiệu cho PA
M:Marker 1kp , giếng1: chứng âm , giếng 2: DNA EI, 3-11: các chủng PS5; PS8;PS9;PS10;PS11;PS12; PS39;PS41; PS42
Trên ảnh điện di, đoạn gen PA là một băng DNA rõ nét với độ dài khoảng 956bp (đúng theo tính toán lý thuyết) được thấy trên gel agarose. Cả 11 chủng phân lập được cho kết quả dương tính, chủng vi khuẩn Edwrdseilla Ictaluri cho kết quả âm tính. Qua đó có thể khẳng định rằng cặp mồi được sử dụng rất đặc hiệu, chương trình phản ứng rất phù hợp cho cặp mồi trên và kết quả nhận được hoàn toàn chính xác.
Như vậy, gen PA là gen đặc trưng loài và được coi là chỉ thị phân tử để phát hiện P. aeruginosa.