Chúng tôi lựa chọn chủng PS39 để tiến hành tách dòng tái tổ hợp mang đoạn gen 16s rRNA. Sản phẩm PCR (đoạn gen 16s rRNA) của chủng PS39 sau khi được làm sạch được gắn vào vectơ tách dòng pCR TOPO 2.1 đã mở vòng, thành phần phản ứng và các bước tiến hành được thực hiện theo mô tả ở phần phương pháp nghiên cứu. Sau đó, vectơ tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Sau khi biến nạp, các thể biến nạp được cấy trải trên môi trường chọn lọc chứa Kanamycin, chất cảm ứng IPTG và chất chỉ thị màu X-gal. Trên môi trường chọn lọc này, theo lý thuyết thì các khuẩn lạc E. coli mang vectơ
tái tổ hợp sẽ có màu trắng trong khi đó các khuẩn lạc mang vectơ pCR TOPO 2.1 không được gắn đoạn DNA ngoại lai sẽ có màu xanh. Kết quả biến nạp như hình 3.7.
Hình 3.7: Màu sắc khuẩn lạc sau khi biến nạp
Tất cả các khuẩn lạc phát triển được trên môi trường có Kanamycine đều là chủng E.coli mang plasmid. Những khuẩn lạc xanh xuất hiện là do vectơ pCR
TOPO 2.1 mang lac operon hoạt động bình thường, khi có chất cảm ứng IPTG, operon sẽ tổng hợp enzyme β-galactosidaza. Enzyme này chuyển hoá cơ chất X- gal thành hợp chất có màu xanh. Khuẩn lạc có màu trắng có thể là do mang plasmid có lac operon không hoạt động. Lac operon bị bất hoạt là do nó bị thay đổi cấu trúc, bị đứt đoạn hay bị thay đổi trình tự hoặc có thể do đoạn DNA ngoại lai gắn vào giữa vùng promotor của operon và gen cấu trúc lac Z. Trong trường hợp này, lac promotor không thể điều khiển gen cấu trúc phiên mã nên không có sự dịch mã thành enzyme. Chính vì vậy, khi có mặt của chất cảm ứng IPTG enzyme β- galactosidaza vẫn không được tổng hợp. Tuy nhiên, không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều mang plasmid tái tổ hợp. Mặc dù vậy, việc chọn các khuẩn lạc trắng để tách chiết các plasmid đã loại bỏ được phần lớn các trường hợp không mong muốn.
* Kiểm tra chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp.
Để chọn lọc dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen 16s rRNA cần tách dòng, chúng tôi chọn ba khuẩn lạc trắng cấy vào ba ống, mỗi ống chứa 5ml môi trường LB lỏng có bổ sung Kanamycine và X-gal, nuôi qua đêm ở 37oC có lắc, sau đó tiến hành tách chiết DNA plasmid và cắt kiểm tra bằng EcoRI, các bước tiến hành và thành phần phản ứng được thực hiện theo mô tả ở phần phương pháp. Sản phẩm cuối cùng được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, đệm TAE 1X, nhuộm ethidium bromide. Kết quả được trình bày trên hình 3.8.
M 1 2 3
Hình 3.8: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm cắt của các DNA plasmid
M: Marker 1kb
1,2,3: Sản phẩm cắt DNA của khuẩn lạc số 1, 2, 3
Kết quả trên điện di đồ cho thấy mẫu 1 và 3 gồm 2 băng: băng 1500bp đúng với kích thước đoạn gen chuyển nạp và vectơ pCR TOPO 2.1 với kích thước 3,9Kb. Mẫu 2 chỉ có một băng của vectơ pCR TOPO 2.1 với kích thước 3,9Kb chứng tỏ đoạn gen 16s rRNA chưa gắn được vào vectơ tách dòng pCR TOPO 2.1.
Như vậy đoạn gen 16s rRNA đã được tạo dòng thành công ở khuẩn lạc số 1 và 3. Chúng tôi đã lựa chọn khuẩn lạc số 1 để tinh sạch và xác định trình tự gen.