Hoạt tính diệt tế bào ung thư thử nghiệm được tiến hành tại Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tất cả các hợp chất phân lập được được kiểm tra hoạt tính gây độc tế bào ung thư đối với 3 dòng tế bào ung thư người bao gồm: ung thư phổi (A-549), ung thư cổ tử cung (Hela), và ung thư biểu mô tuyến tụy (PANC-1). Các dòng tế bào này được đánh giá bằng các xét nghiệm đo màu dựa trên phương pháp MTT. Kết quả được trình bày trong bảng 4.9 và bảng 4.10.
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
4.1.1. Hợp chất 1: 3β,5α-dihydroxyeudesma-4(15), 11-diene (chất mới)
Hợp chất 1 được phân lập dưới dạng dầu, không màu. Trên phổ HR-ESI-MS (Hình 4.1.1a) xuất hiện pic giả ion phân tử tại m/z 237,18549 [M+H]+, cùng với dữ liệu phổ 13C-NMR cho phép xác định công thức phân tử C15H24O2 (tính toán lý thuyết C15H24O2+ 237,18491), số liên kết đôi tương đương là 4.
Hình 4.1.1a. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 1
Trên phổ 1H-NMR (hình 4.1.1b) xuất hiện các tín hiệu của 2 nhóm methyl bậc 3 [ 1,67 (s, H-13) và 1,06 (s, H-14)], 01nhóm methine gắn trực tiếp với oxy [
4,49 (br d, J=10 Hz, H-3)] , 01 nhóm exomethylen điển hình cho liên kết đôi ngoại vòng [ 5,15 (br s, H-15a) và 5,42 (br d,J=1,5 Hz, H-15b].
Hình 4.1.1b. Phổ 1
H-NMR của hợp chất 1
Ngoài ra còn có tín hiệu của 1 nhóm methine và 6 tín hiệu của nhóm methylene trong đó có 1 nhóm methylene [4,72 (br s, H-12a) và 4,74 (br s, H-12b)] chuyển dịch về phía trường thấp hơn so với các methylene khác.
Hình 4.1.1c. Phổ 13
Trên phổ 13C-NMR (hình 4.1.1c) và phân tích phổ HSQC (hình 4.1.1d) cho
thấy sự có mặt của nhóm carbon exomethylene [ 152,43 (C-4) và 107,09 (C-15)], 01 carbon olefinic tại [ 149,25 (C-11)] và 01 methylene olefinic tại [ 108,74 (C- 12)], 02 methyl carbon bậc 4 tại [ 20,67 (C-13) và 22,07 (C-14)], 01 carbon không liên kết trực tiếp với hydro, có liên kết trực tiếp với oxy [ 76,59 (C-5)] và 01 methine carbon liên kết với oxy [ 69,87 (C-3)], 01 carbon bậc 4 tại [ 38,42 (C- 10)], 01 carbon bậc 3 liên kết với nhóm isopropenyl tại [ 42,80 (C-7)], 05 carbon bậc 2 tại [ 34,41 (C-1); 31,40 (C-2); 38,09 (C-6); 26,49 (C-8) và 33,55 (C-9). Với 15 carbon và các đặc điểm nêu trên, hợp chất có dạng sesquiterpene eudesmane [9]. Từ số liên kết đôi tương đương là 4, trừ đi 02 liên kết đôi đã được xác định nêu trên, suy ra trong phân tử có thêm hai vòng cyclohexane liên kết tại vị trí C-5 và C-10.
Tiếp tục phân tích tiếp các tương tác 1H-13C thu được từ việc phân tích phổ HSQC (hình 4.1.1d) của hợp chất 1, các số liệu thu được trình bày trên bảng 4.1
Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất 1 C Ca Cb,c Hb,d độ bội (J = Hz) HMBC (1H 13 C) 1 72,2 34,41 1,28 m/1,96 m 2 41,1 31,40 1,54 m/1,90 m 3 3 68,2 69,87 4,49 br d (11,0) 4 155,4 152,43 - 5 76,7 76,59 - 6 37,1 38,09 1,73 m/2,00 m 5, 7, 8, 10 7 40,7 42,80 2,33 m 8 27,1 26,49 1,55 m 9 31,3 33,55 1,10 m/1,67 m 10 43,2 38,42 - 11 151,8 149,25 - 12 109,0 108,74 4,72 br s/4,74 br s 7, 11, 13 13 21,2 20,67 1,67 s 7, 11, 12 14 13,5 22,07 1,06 s 1, 9, 10 15 105,6 107,90 5,15 br s/5,42 d (1.5) 3, 4, 5
Hình. 4.1.1d. Phổ HSQC của hợp chất 1
Các nghiên cứu của nhóm tác giả Thomas A. F và cộng sự [5] cho thấy đối với các hợp chất sesquiterpene eudesmane với hai vòng cyclohexane liên kết tại vị trí C-5 và C-10 ở kiểu trans thì độ chuyển dịch hóa học 13C của nhóm tert-methyl liên kết trực tiếp với carbon bậc 4 tại C-10 dịch chuyển về phía trường cao với C
<20 ppm, trong khi hiệu ứng của -gauche của nhóm hydroxy tại vị trí C-1 ở dạng sẽ làm cho độ dịch chuyển 13C của nhóm tert-methyl liên kết trực tiếp với carbon
bậc 4 tại C-10 chuyển dịch về phía trường cao với giá trị 8,5 [5][ 27][ 31][ 35]. Đối với hợp chất 1, độ chuyển dịch hóa học 13
C của nhóm tert-methyl tại C-14 (
22,07), giá trị này phù hợp do trên hợp chất không còn nhóm hydroxy tại vị trí C-1, hiệu ứng -gauche của nhóm hydroxy đã không còn. Nhận định này cũng phù hợp khi so sánh số liệu phổ của hợp chất canusesnol E [16] độ chuyển dịch hóa học 13
C
của nhóm tert-methyl tại C-14 ( 13,5) với hai vòng cyclohexane liên kết tại vị trí C-5 và C-10 ở kiểu trans và hiệu ứng -gauche của nhóm hydroxy.
Tác giả Cocker W và cộng sự [9] đã chứng minh các hợp chất eudesmane sesquiterpene có nhóm isopropyl ở dạng equatorial đối với vòng cyclohexane. Đồng thời phân tích phổ NOESY (hình 4.1.1f) cho thấy tương tác giữa H-7 (H 2,33) với
H-9 (H 1,67). Do vậy proton H-7 sẽ cùng phía với nhóm thế tại vị trí C-5, sự thay đổi nhóm thế tại vị trí C-5 sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến độ chuyển dịch hóa học tại C- 7. Các hợp chất như canusesnol B, E có độ chuyển dịch hóa học của proton tại C-7 tương ứng là 1,84; 2,53 ppm [16], rõ ràng sự dịch chuyển về phía trường thấp là do nhóm thế cùng phía, trong trường hợp các chất canusesnol B, E thì nhóm thế tại C-5 là -hydroxyl.
Hình 4.1.1e. Phổ HMBC của hợp chất 1
Các phân tích trên phổ HMBC (hình4.1.1e) cho thấy: tương tác HMBC giữa proton H3-13 (H 1,67) với C-7 (C 42,80); C-11 (C 149,25); C-12 (C 108,74) và tương tác giữa proton H-12a (H 4,72)/ H-12b (H 4,74) với C-7 (C 42,80), C-11 (C 149,25) cho thấy sự có mặt của nhóm isopropenyl tại C-7. Tương tác giữa proton H3-14 (H 1,06) với C-1 (C 34,41); C-5 (C 76,59); C-9 (C 33,55) và C-10 (C 38,42) cho thấy nhóm methyl liên kết với carbon bậc 4 tại vị trí C-10 (C 38,42), sự có mặt của nhóm carbon không liên kết trực tiếp với hydro, liên kết trực tiếp với
Hình 4.1.1f. Phổ NOESY của hợp chất 1
Tương tác giữa proton H-15a (H 5,15)/ H-15b (H 5,42) với C-5 (C 76,59); C-3 (C 69,87) khẳng định sự có mặt nhóm oxygenated methine carbon tại C-3 (C 69,87). Tiếp tục phân tích các tương tác HMBC còn lại và so sánh độ chuyển dịch hóa học của các vị trí còn lại trên cấu trúc của hợp chất 1 với vị trí tương ứng trên cấu trúc canusesnol E [16], kết quả so sánh cho thấy sự khác biệt tại vị trí C-1 trên cấu trúc của hợp chất 1 so với canusesnol E, cụ thể độ chuyển dịch hóa học 13C của hợp chất 1 tại các vị trí C-1 (C 34,41) trong khi của canusesnol E tương ứng C-1 (C 72,2). Các vị trí khác còn lại là tương đương, ngoại trừ những vị trí bị ảnh hưởng bởi sự thay thế của nhóm hydroxy trên cấu trúc của canusesnol E bằng nhóm methylene trên cấu trúc của hợp chất 1. Độ chuyển dịch hóa học 13C tại C-3 (C
69,87); C-5 (C 76,59) và C-15 (C 107,9) của hợp chất 1 trong khi độ chuyển dịch hóa học 13C tại C-3 (C 68,2); C-5 (C 76,7) và C-15 (C 105,6) của canusesnol E có nhóm hydroxy tại C-3, C-5 ở dạng , [16], độ chuyển dịch hóa học 13C tại C-3 (C
trihydroxyeudesma-4(15), 11-dien) có nhóm hydroxy tại C-3, C-5 ở dạng [33]. Đồng thời với hằng số tương tác của proton H-3 ở dạng broad doublet với J=11,0 Hz, cho thấy hằng số tương tác lớn giữa proton H-3 (H 4,49) với H-2 (H 1,54). Phân tích phổ NOESY (hình 4.1.1f) cho thấy tương tác yếu giữa H-3 (H 4,49) với H-2 (H 1,90), tương tác rõ giữa H3-14 (H 1,06) với H-2 (H 1,54) cho phép khẳng định proton H-3 ở vị trí , nhóm hydroxy tại C-3 ở dạng . Dựa trên các số liệu và các lập luận nêu trên, hợp chất 1 đã được xác định, đây là hợp chất mới và được đặt tên là 3, 5-dihydroxyeudesma-4(15),11-diene (hình 4.1.1g).
Hình 4.1.1g. Các tương tác HMBC chính và cấu trúc hóa học của hợp chất 1
4.1.2. Hợp chất 2: 4(15)-Eudesmene-1β,6α-diol
Hợp chất 2 được phân lập dưới dạng dầu, không màu. Trên phổ 1H-NMR (hình 4.1.2a) xuất hiện các tín hiệu của 03 nhóm methyl tại H 0,71; 0,87 và 0,96. Phổ 13C-NMR (hình 4.1.2a) xuất hiện tín hiệu của 15 carbon bao gồm 05 methine carbon, 04 carbon methylene lai hóa sp3, 01 exomethylene carbon, 03 methyl carbon và 02 carbon bậc 4. Phân tích các tương tác 1H-13C thu được từ việc phân tích phổ HSQC (hình 4.1.2c) của hợp chất 2 cho thấy các tín hiệu cộng hưởng của proton H 0,87 (H3-12) với C 16,22 (C-12), giữa proton H 0,96 (H3-13) với C 21,1 (C-13) và giữa proton H 2,24 (H-11) với C 26,05 (C-11), cùng với hằng số tương tác tại H3-12 và H3-13 ở dạng doublet và độ chuyển dịch hóa học của các vị trí này cho thấy sự có mặt của nhóm isopropryl. Phân tích tiếp các tín hiệu cộng hưởng
giữa proton H 0,71 (H3-14) với C 11,6 (C-14) cùng với hằng số tương tác ở dạng singlet có thể nhận dạng đây là nhóm tert-methyl. Các tín hiệu cộng hưởng giữa proton H 4,75 (H-15a) và 5,02 (H-15b) với C 107,82 cùng với sự có mặt của carbon bậc 4 tại C 146,26 (C-4) cho thấy sự có mặt của liên kết đôi ngoại vòng,
tương ứng với sự có mặt của nhóm exomethylen trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton. Tín hiệu cộng hưởng giữa proton H 3,43 với C 79,06 (C-1), giữa proton
H 3,72 với C 67,04 (C-6) cho thấy sự có mặt của methin carbon có liên kết trực tiếp với oxy, xác định sự có mặt của 02 nhóm oxymethine trong phân tử.
Hình 4.1.2a. Phổ 1
H-NMR của hợp chất 2
Hình 4.1.2b. Phổ 13
Hình 4.1.2c. Phổ HSQC của hợp chất 2
Tiếp tục phân tích tiếp các tương tác 1H-13C thu được từ việc phân tích phổ HSQC (hình 4.1.2c) của hợp chất 2, các số liệu thu được trình bày trong bảng 4.2
Bảng 4.2 Số liệu phổ NMR của hợp chất 2 C aC Cb,c Hb,d dạng pic (J = Hz) HMBC (1H 13C) 1 79,0 79,06 3,43 dd (4,5; 11,5) 2 31,9 31,95 1,55 m/1,85 m 3 35,1 35,12 2,07 dt (5,5; 13,5) 2,33 ddd (2,0; 5,0; 13,5) 4 146,2 146,26 - 5 55,9 55,93 1,75 d (10,0) 6 67,0 67,04 3,72 t (10,0) 7 49,3 49,37 1,28 m 8 18,2 18,21 1,23 m/1,53 m 9 36,3 36,33 1,17 m/1,92 m 10 41,7 41,72 - 11 26,0 26,05 2,24 m
12 16,2 16,22 0,87 d (7,0) 7, 13
13 21,1 21,10 0,96 d (7,0) 7, 11, 12
14 11,6 11,60 0,71 s 1, 9, 10
15 107,8 107,82 4.75 br s/5.02 br s 3, 4, 5
aCcủa hợp chất 4(15)-eudesmene-lβ,6-diol, b đo trong CDCl3, c125 MHz, d500 MHz
Các phân tích trên phổ HMBC (hình 4.1.2d) cho thấy: Tương tác HMBC giữa proton H3-12 (H 0,87) với C-7 (C 49,37); C-11 (C 26,05); C-13 (C 21,10); Tương tác giữa proton H3-13 (H 1,25) với C-7 (C 49,37), C-11 (C 26,05), C-12 (C 16,22); Tương tác giữa proton H3-14 (H 0,71) với C-1 (C 79,06), C-5 (C
55,93), C-9 (C 36,33) và C-10 (C 41,72). Tương tác giữa proton H-15a (H 4,75)/ H-15b (H 5,02) với C-5 (C 55,93), C-3 (C 35,12). Cùng với các tương tác HMBC khác cho phép xác định sự có mặt của nhóm carbon bậc 3 mang oxy tại C-1, C-6, nhóm isopropyl và nhóm methyl góc liên kết với carbon bậc 4 tại vị trí C-10, nhóm methine carbon tại vị trí C-5, C-7. Từ các dữ kiện nêu trên có thể khẳng định bộ khung của hợp chất ở dạng sesquiterpene eudesmane [9], các vị trí lập thể của hợp chất này là C-1, C-5, C-6, C-7 và C-10. Có thể nhận thấy hợp chất có hai vòng cyclohexane, liên kết giữa hai vòng cyclohexane tại vị trí C-5 và C-10, vị trí tert- methyl ở C-10 ở dạng . Do đó tùy thuộc vào lập thể của proton H-5 ở dạng hoặc , hình thành dạng cis hoặc dạng trans tương tự như đối với cis-decalin và trans- decalin. Tiếp tục phân tích độ chuyển dịch hóa học của proton H-5 với H 1,75 (1H; d; j= 10 Hz) và proton H-6 với H 3,72 (1H; t; j=10 Hz), với hằng số tương tác giữa proton H-5 và H-6 cho thấy hai proton có góc lệch >900, và hai proton này ở hai vị trí đối ngược nhau (Trong trường hợp hai proton này cùng phía, góc lệch trong khoảng 600 sẽ không làm xuất hiện được hằng số tương tác lớn trên proton H- 6 theo tính toán lý thuyết của phương trình Karplus) [12]. Đồng thời với hằng số tương tác proton H-6 ở dạng triplet cho thấy sẽ tồn tại đồng thời hai giá trị J lớn tương ứng với J5,6diaxial và J6,7diaxial minh chứng này cho thấy H-6 cũng ở vị trí ngược lại so với H-7, điều này cho thấy H-5 và H-7 ở cùng phía.
Hình 4.1.2d. Phổ HMBC của hợp chất 2
Tác giả Cocker và cộng sự [9] đã chứng minh các hợp chất eudesmane sesquiterpene có nhóm isopropyl ở vị trí equatorial đối với vòng cyclohexane. Nếu như nhóm isopropyl ở dạng equatorial đối với vòng cyclohexane vậy có thể khẳng định H-7 cùng phía với H-5 và ở vị trí axial, tương ứng với H-6 ở vị trí axial và ngược phía với H-5, H-7. Hiệu ứng -gauche của nhóm hydroxy tại vị trí C-1 và ảnh hưởng hiệu ứng không gian của proton H-5 ở dạng hoặc trực tiếp lên độ chuyển dịch hóa học của nhóm methyl bậc 3 liên kết trực tiếp với carbon bậc 4 tại C-10 đã được chứng minh bởi các tác giả [5][ 27][ 31][ 35], trong khi hai vòng cyclohexane liên kết ở dạng cis thì độ chuyển dịch hóa học 13C của nhóm methyl C- 14 dịch chuyển về phía trường thấp hơn với C >20 ppm [5][ 27][ 31][ 35]. Trong khi đó vòng cyclohexane liên kết ở kiểu trans thì độ chuyển dịch hóa học 13C của nhóm methyl C-14 dịch chuyển về phía trường cao với C <20 ppm tính cả hiệu ứng của -gauche của nhóm hydroxy tại vị trí C-1 ở dạng hoặc [5][ 27][ 31][ 35]. Đối với hợp chất 2, độ chuyển dịch hóa học của 13
C tại C-14 tương ứng là C 11,60 cho thấy liên kết giữa 2 vòng cyclohexane ở kiểu trans, khi đó cả H-5 và H-7 ở dạng , H-6 ở dạng . Đồng thời độ chuyển dịch hóa học 13C tại C-1 (C 79,06), độ
chuyển dịch hóa học của proton tại H-1 (H 3,43 ) phù hợp hoàn toàn với các giá trị về độ chuyển dịch hóa học tương ứng của hợp chất 4(15)-eudesmene-lβ, 6-diol, các kết quả so sánh được trình bày trên bảng 4.2. Từ các dẫn liệu nêu trên, có thể khẳng định hợp chất 2 là 4(15)-eudesmene-lβ, 6-diol (hình4.1.2e).
Hình 4.1.2e. Các tương tác HMBC chính và cấu trúc hóa học của hợp chất 2
4.1.3. Hợp chất 3 :6-Hydroxy-eudesm-4(15)-ene-1-one
Hợp chất 3 được phân lập dưới dạng dầu, không màu. Trên phổ 1H-NMR (hình 4.1.3a) cho thấy sự có mặt của 02 nhóm methyl bậc 2 [ 0,88 (d, j=7,0Hz, H- 12), 0,96 (d, j=7,0Hz, H-13)], 01 nhóm methyl bậc 3 [1,00 (s, H-14)], 01 nhóm oxymethine [3,83 (dt, j=10, 2,5Hz, H-6)], 01 nhóm exomethylene [5,00 (br s, H- 15a) và 5,26 (br s, H-15b].
Hình 4.1.3a. Phổ 1
Trên phổ 13C-NMR (hình 4.1.3b) và phân tích phổ HSQC (hình 4.1.3c) cho thấy tín hiệu của 01 carbon carbonyl [ 213 (C-1)], nhóm exomethylene carbon [
144,07 (C-4) và 110,10 (C-15)], 03 methyl carbon [ 16,18 (C-12); 21,01 (C-13) và 17,91 (C-14)], 04 methine carbon [ 55,54 (C-5); 67,09 (C-6), 49.08 (C-7) và 26,00 (C-11)], 04 methylene carbon [ 38,32 (C-2); 35,41 (C-3); 17,91 (C-8) và 31,50 (C- 9)], 01 carbon bậc 4 [ 50,10 (C-10)].
Với sự có mặt của 15 carbon và các đặc trưng nêu trên cho thấy hợp chất thuộc dạng sesquiterpene eudesmane với hai vòng cyclohexane liên kết tại vị trí C-5 và C-10 [9].
Hình 4.1.3c. Phổ HSQC của hợp chất 3
Tiếp tục phân tích tiếp các tương tác 1H-13C thu được từ việc phân tích phổ HSQC (hình 4.1.3c) của hợp chất 3, các số liệu thu được trình bày trong bảng 4.3.
Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất 3 C Ca Cb,c Hb,d dạng pic (J = Hz) HMBC (1H 13 C) 1 213,2 213,28 - 2 38,3 38,32 2,40 m/2,65 m 3 35,4 35,41 2,37 m/2,60 m 4 144,4 144,07 - 5 55,5 55,54 2,11 d (9,5) 6 67,1 67,09 3,83 dt (2,5, 10,0) 7 49,1 49,08 1,25 m 8 17,9 17,91 1,23 m/1,58 m 9 31,5 31,50 1,56 m/1,79 m 10 50,1 50,10 - 11 26,0 26,00 2,23 m 12 16,2 16,18 0,88 d (7,0) 7, 13
13 21,0 21,01 0,96 d (7,0) 7, 11, 12
14 17,9 17,91 1,00 s 1, 9, 10
15 110,1 110,10 5,00 br s/5,26 br s 3, 4, 5
aCcủa hợp chất 6-hydroxy-eudesm-4(15)-ene-1-one, b đo trong CDCl3, c125 MHz, d500 MHz
Tiến hành các phân tích chi tiết các thông tin trên phổ HMBC (hình 4.1.3d) như đối với hợp chất 2 cho phép xác định sự có mặt của 01 carbon methin mang oxy tại C-6, carbon carbonyl tại C-1, nhóm isopropyl tại C-11, C-12 và C-13 và nhóm methyl góc liên kết với carbon bậc 4 tại vị trí C-10, 02 methin carbon tại vị trí C-5, C-7 và liên kết đôi ngoại vòng tại C-4 và C-15. Từ những dữ liệu nêu trên có thể khẳng định hợp chất 3 có hai vòng cyclohexane, liên kết giữa hai vòng cyclohexane tại vị trí C-5 và C-10, vị trí methyl ở C-10 ở dạng.