Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.
Phương pháp MTT được sử dụng để nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính diệt tế bào ung thư. Nguyên tắc của phương pháp này là đánh giá hoạt động trao đổi chất của tế bào sống thông qua hoạt động của enzyme oxidoreductase phụ thuộc NADPH. Enzyme này sẽ khử thuốc nhuộm 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5 diphenyltetrazolium bromide (MTT) thành sản phẩm formazan có màu tím và không tan. Giá trị mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được của formazan sau khi hòa tan trong dung môi thích hợp sẽ phản ánh mức độ hoạt động của enzyme, tương ứng với độ sống của tế bào [7][ 22]. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
- Tế bào được nuôi trong đĩa 96 giếng với mật độ 2.0 x 104 tế bào/ml, ủ ở nhiệt độ 37oC, 5% CO2 trong 24 giờ.
- Tế bào được xử lý với các hợp chất ở những nồng độ khác nhau (0.3, 1, 3, 10, 30, và 100 l trong DMSO), ủ ở nhiệt độ 37oC, 5% CO2 trong 48 giờ.
- Sau đó, dung dịch MTT 0.5 mg/ml lần lượt được thêm vào và tiếp tục ủ ở nhiệt độ 37oC, 5% CO2 trong 4 giờ.
- Hàm lượng formazan tạo thành được đánh giá bằng phương pháp đo mật độ quang OD ở bước sóng 570 nm, sẽ phản ánh số lượng tế bào sống trong dịch nuôi cấy.
Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:
% sống sót = [OD(chất thử) - OD(môi trường trắng)] x 100%
OD(đối chứng âm) - OD(môi trường trắng) % ức chế = 100% % sống sót
% ức chế ˃ 50% sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp trên giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển).
- Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Etoposide và camptothecin được sử dụng như là chất đối chứng dương.
- DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 sẽ được xác định nhờ vào phần mềm TableCurve. Trong khuôn khổ luận văn này, chất thử nào có IC50 < 100 μg/ml (với chất chiết thô hoặc phân đoạn hóa học) hoặc IC50 100
M (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư.
Phương pháp nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính diệt tế bào ung thư được thử nghiệm tại phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.