2.3.1.1 Phương pháp xử lý mẫu
Việc xử lý các mẫu sinh vật biển được thực hiện theo quy trình thống nhất đã được xây dựng qua các nhiệm vụ khoa học của Viện Hóa sinh biển:
Bước 1: Mẫu san hô mềm sau khi lấy ra khỏi tủ lạnh âm sâu được tiến hành rã đông bằng cách để trên bệ rửa thí nghiệm, cho nước sạch chảy đều trên bề mặt của mẫu nghiên cứu, các lớp đá bao quanh mẫu san hô mềm được tan từ từ để lộ phần thân của mẫu san hô mềm. Mẫu được ngâm trong nước lạnh trong thời gian từ 2-3 giờ nhằm loại bỏ từ từ hàm lượng muối vô cơ.
Bước 2: Sau khi mẫu san hô mềm đã được rã đông, loại bỏ các phần túi nylon và các thành phần vi sinh vật biển khác bám trên bề mặt của mẫu san hô mềm. Lưu lại tiêu bản mẫu, để mẫu sinh vật biển lên mặt bàn thí nghiệm và chụp ảnh để lưu phần mẫu trước khi xử lý.
Bước 3: Sau khi mẫu san hô mềm đã được loại bỏ các thành phần nylon và các thành phần khác, mẫu được để trên túi lưới ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô hết bề mặt của phần thân mẫu san hô mềm. Mẫu được cân để thu được khối lượng thực tế trước khi tiến hành xử lý.
Bước 4: Mẫu được cắt nhỏ thành từng phiến, chiều rộng và dài của phiến tùy theo độ cứng của mẫu san hô mềm. Các phiến càng mỏng thì khả năng làm khô mẫu và xay mẫu càng thuận lợi.
Bước 5: Sấy và làm khô các mẫu san hô mềm. Các mẫu san hô mềm sau khi đã được cắt thành các phiến nhỏ được chuyển vào túi lưới và tiến hành làm khô sơ bộ bằng phương pháp sấy khô trên thiết bị tủ sấy chân không hoặc phơi dưới điều kiện ánh sáng mặt trời (có tránh tia tử ngoại). Trong quá trình sấy mẫu này, khối lượng mẫu san hô mềm giảm xuống rất nhanh.
Bước 6: Làm khô mẫu trên thiết bị đông khô.
2.3.1.2. Phương pháp nghiên cứu tạo dịch chiết phân đoạn
Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử: Các mẫu san hô mềm được lấy lượng 5 mg mẫu khô, cho vào bình định mức 10 ml.
Bước 2: Đánh số thứ tự và ký hiệu các bình chiết mẫu. Thêm dung môi theo thứ tự tăng dần độ phân cực, dung môi được thêm đến vạch định mức.
Bước 3: Toàn bộ các bình chiết được cho lên máy lắc ngang, lắc đều cho dung môi thấm đều trên bột san hô mềm. Để lắng trong khoảng 1-2 giờ.
Bước 4: Lọc mẫu, phần dịch lọc được cất loại dung môi trên thiết bị cất quay, dịch thô thu được cho vào lọ nhỏ phục vụ cho việc kiểm tra lượng vết chất và khả năng hòa tan mẫu nghiên cứu.
Bước 5: Sử dụng sắc ký bản mỏng TLC và hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH với tỷ lệ thích hợp để đánh giá các mẫu thô thu được.
2.3.1.3. Phương pháp phân lập chất
- Sắc ký lớp mỏng: Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng.
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ đến khi hiện màu.
- Sắc ký cột: Nguyên lí tách của sắc kí cột cũng như của các loại sắc ký khác: một mẫu thử được nạp lên một cột chứa chất hấp phụ (thường là silica gel, nhôm oxide).Cột chứa chất hấp phụ này đóng vai trò là một pha tĩnh. Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo cột sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử, do các cấu tử này có độ phân cực khác nhau nên ái lực của chúng với pha tĩnh cũng
khác nhau. Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 μm, FuJisilisa Chemical Ltd.).
- Hệ thống sắc ký lỏng trung áp (MPLC): Hệ thống bao gồm Detector UV-vis bước sóng từ 200-900 nm, bộ lấy mẫu tự động (fraction collector) kèm theo với các dãy ống nghiệm kích thước thay đổi tùy theo lượng mẫu, hệ thống bơm với khả năng điều chỉnh áp từ 1 đến 10 bar, tốc độ dòng từ 1ml/phút đến 200 ml/phút. Cột tách SNAP loại C8, C18 với dung lượng từ 100g đến 450g mẫu đầu vào.
- Hệ thống lấy mẫu tự động (Fraction collector): Mẫu được đưa qua cột sắc ký bằng thủy tinh với pha tĩnh là silica gel pha thường hoặc pha đảo. Cơ chế phân tách dựa trên sự tương tác giữa chất và pha tĩnh, dung môi với tỷ lệ phù hợp. Mẫu được thu thập thông qua máy lấy mẫu tự động.
Các thiết bị sử dụng nêu trên thuộc Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.