Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm

 Nguyên lý

Gốc tự do nitric oxide (•NO) được sản sinh ở nhiều loại tế bào khác nhau. Dạng •NO xuất tiết có mặt ở các tế bào như đại thực bào, nguyên bào sợi hay tế bào gan thường được sản sinh với lượng lớn khi xuất hiện các đáp ứng viêm [40].

Một phương pháp được sử dụng để xác định gián tiếp •NO là đo màu các thành phần sản phẩm của nó (nitrate và nitrite). Phản ứng này đòi hỏi rằng nitrate (NO3) đầu tiên được giảm thành nitrite (NO2), do tác động của nitrate reductase.

NO3- Nitrate reductase NO2- Nitrate Nitrite

Nitrite được phát hiện và phân tích bằng cách hình thành một màu hồng đỏ khi mẫu thử có chứa NO2- với thuốc thử Griess.

Khi thêm axit sulphanilic, nitrite tạo thành muối diazonium, sau đó các thuốc nhuộm azo (N-alpha-naphthyl-ethylenediamine) được thêm vào để tạo thành màu hồng.

Phương pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) là một phương pháp so màu, đo độ suy giảm màu để đánh giá khả năng sống sót của tế bào. Ở các tế bào sống, hệ enzyme oxidoreductase hoạt động mạnh, những enzyme này có khả năng phân giải MTT thành dạng formazan không hoà tan, màu tím đậm. Do vậy, tỉ lệ tế bào sống sót được suy ra từ lượng formazan tạo thành từ MTT. Lượng formazan tạo thành được hoà tan bởi dung môi hữu cơ (DMSO, propanol) và đo độ hấp thụ ở bước sóng 570 mm. Khả năng gây độc tế bào của các mẫu thử nghiệm được suy ra từ việc đánh giá khả năng sống sót của tế bào.

 Các bước tiến hành:

Tế bào RAW264.7 được nuôi cấy 48 giờ trong môi trường DMEM ở 37oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin và streptomycin sulphate. Sau đó chúng được nuôi cấy trong giếng phiến 96 với mật độ 2,5 x 105

tế bào/giếng. Tế bào được kích thích với LPS trong 24 giờ với sự có mặt của các hợp chất thử ở nhiều nồng độ khác nhau, được pha sẵn trong DMSO. Dịch nổi của tế bào phản ứng với thuốc thử Griess. NaNO2 ở các nồng độ khác nhau được sử dụng để xây dựng đường chuẩn. Độ hấp thụ được đo ở 570 nm. Cardamonin được sử dụng làm mẫu đối chứng [41].

Phần tế bào còn lại sau khi đã sử dụng để đánh giá các hoạt tính invitro được bổ sung dung dịch MTT (5mg/mL), ủ 4h ở 37oC và 5% CO2. Sau đó hút bỏ hết môi trường trên bề mặt, kết tủa formazan được hòa tan trong isopropanol. Độ hấp thụ được đo ở 570 nm

CHƯƠNG 3- THỰC NGHIỆM 3.1. Phân lập các hợp chất từ san hô mềm Sinularia erecta 3.1.1. Phân lập các hợp chất

Mẫu san hô mềm Sinularia erecta tươi (1,5 kg) sau khi được xử lý theo phương pháp xử lý mẫu sinh vật biển, được cắt thành từng miếng nhỏ và ngâm chiết MeOH sử dụng sóng siêu âm 3 lần (mỗi lần 2h) ở nhiệt độ phòng thu được cặn chiết MeOH tổng (150 g, M). Cặn MeOH được hòa vào nước (1.0 lít) và chiết phân lớp với n-hexane. Cô quay loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết n- hexane (48g, H) . Sau đó phần dịch nước được bổ sung dichloromethane tỉ lệ 1 : 1 thu được căn chiết dichloromethane (2g , D).

Hình 3.1. Sơ đồ chiết các phân đoạn từ mẫu Sinularia erecta

Cặn chiết H và D được tiến hành phân tách thô bằng hệ thống sắc ký lỏng trung áp với cột nhồi silica gel pha thường. Rửa giải gradient bằng hệ dung môi dichloromethane : methanol (từ 100:1 đến 1:1) thu được 9 phân đoạn (H1→H9). Phân đoạn H3 (2g) tiếp tục được phân tách bằng hệ thống sắc ký lỏng trung áp với

cột pha đảo YMC RP-18, sử dụng pha động là methanol: nước (2:1) thu được 2 phân đoạn ký hiệu H3A và H3B. Phân đoạn H3A (120 mg) được phân tách tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi dichloromethane: acetone (20/1) kết hợp với sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane : etyl acetate 5/1 thu được hợp chất 4 (1,8 mg). Phân đoạn H3B (900 mg) được phân tách tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane : acetone (10/1) kết hợp với sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải bằng hệ dung môi dichloromethane: etyl acetate 5/1 thu được hợp chất 5 (2,8 mg).

Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn n-Hexan (H)

Phân đoạn H4 + H5 (10g) được phân tách bằng hệ thống sắc ký lỏng trung áp với cột pha đảo YMC RP-18, sử dụng pha động là methanol: H2O (1/1 →10/1) thu

được 7 phân đoạn ký hiệu H5A →H5G. Phân đoạn H5B (120 mg) được phân tách tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi dichloromethane: acetone (10/1) kết hợp với sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane : acetone 7/1 thu được 3 hợp chất: 1 (1,5 mg), 2

(3mg), 3 (3,5mg). Phân đoạn H5C (190 mg) được phân tách tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi dichloromethane: acetone (15/1) thu được 4 phân đoạn H5C1- H5C4. Phân đoạn H5C3(16mg) được phân tách trên sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane : acetone 5/1 thu được hợp chất 6 (5 mg). Phân đoạn H5E (55mg ) được phân tách tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi dichloromethane: acetone (10/1) kết hợp với sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải bằng hệ dung môi n- hexane: acetone 5/1 thu được hợp chất 7 (1,6 mg) và hợp chất 8 (4,7mg).

3.1.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được

- Hợp chất 1:3β,5α-dihydroxyeudesma-4(15),11-diene (chất mới)

Chất không màu, dạng dầu; [α]D + 10 ( c = 0,05; CHCl3); Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS m/z 237,18549 [M + H]+ , M =236. Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) được trình bày trên bảng 4.1.

- Hợp chất 2: 4(15)-Eudesmene-1β, 6α-diol

Chất không màu, dạng dầu; [α]D + 10 ( c = 0,05; CHCl3); Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) được trình bày trên bảng 4.2. - Hợp chất 3: 6α-Hydroxy-eudesm-4(15)-ene-1-one

Chất không màu, dạng dầu; [α]D + 40 ( c = 0,05; CHCl3); Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) được trình bày trên bảng 4.3. - Hợp chất 4: 4β,15-epoxyeudesmane-1β, 6α-diol

Chất không màu, dạng dầu; [α]D - 25 ( c = 0,05, CHCl3); Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13

C-NMR (125 MHz, CDCl3) được trình bày trên bảng 4.4. - Hợp chất 5: Aromadendrane-4β, 10α-diol

Chất bột màu trắng; [α]D - 23 ( c = 0,05; CHCl3); Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13

- Hợp chất 6: Aromadendrane-4α, 10α-diol

Chất bột màu trắng; [α]D - 42 ( c = 0,05; CHCl3); Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) được trình bày trên bảng 4.6.

- Hợp chất 7: Aromadendrane-4β, 10β-diol.

Chất bột màu trắng; [α]D - 13 ( c = 0,05, CHCl3); Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) được trình bày trên bảng 4.7.

- Hợp chất 8: Alloaromadendrane-4β, 10α-diol

Chất bột màu trắng; [α]D + 8 ( c = 0,05; CHCl3); Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) được trình bày trên bảng 4.8.

3.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư các hợp chất phân lập được

Hoạt tính diệt tế bào ung thư thử nghiệm được tiến hành tại Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tất cả các hợp chất phân lập được được kiểm tra hoạt tính gây độc tế bào ung thư đối với 3 dòng tế bào ung thư người bao gồm: ung thư phổi (A-549), ung thư cổ tử cung (Hela), và ung thư biểu mô tuyến tụy (PANC-1). Các dòng tế bào này được đánh giá bằng các xét nghiệm đo màu dựa trên phương pháp MTT. Kết quả được trình bày trong bảng 4.9 và bảng 4.10.

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

4.1.1. Hợp chất 1: 3β,5α-dihydroxyeudesma-4(15), 11-diene (chất mới)

Hợp chất 1 được phân lập dưới dạng dầu, không màu. Trên phổ HR-ESI-MS (Hình 4.1.1a) xuất hiện pic giả ion phân tử tại m/z 237,18549 [M+H]+, cùng với dữ liệu phổ 13C-NMR cho phép xác định công thức phân tử C15H24O2 (tính toán lý thuyết C15H24O2+ 237,18491), số liên kết đôi tương đương là 4.

Hình 4.1.1a. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 1

Trên phổ 1H-NMR (hình 4.1.1b) xuất hiện các tín hiệu của 2 nhóm methyl bậc 3 [ 1,67 (s, H-13) và 1,06 (s, H-14)], 01nhóm methine gắn trực tiếp với oxy [

4,49 (br d, J=10 Hz, H-3)] , 01 nhóm exomethylen điển hình cho liên kết đôi ngoại vòng [ 5,15 (br s, H-15a) và 5,42 (br d,J=1,5 Hz, H-15b].

Hình 4.1.1b. Phổ 1

H-NMR của hợp chất 1

Ngoài ra còn có tín hiệu của 1 nhóm methine và 6 tín hiệu của nhóm methylene trong đó có 1 nhóm methylene [4,72 (br s, H-12a) và 4,74 (br s, H-12b)] chuyển dịch về phía trường thấp hơn so với các methylene khác.

Hình 4.1.1c. Phổ 13

Trên phổ 13C-NMR (hình 4.1.1c) và phân tích phổ HSQC (hình 4.1.1d) cho

thấy sự có mặt của nhóm carbon exomethylene [ 152,43 (C-4) và 107,09 (C-15)], 01 carbon olefinic tại [ 149,25 (C-11)] và 01 methylene olefinic tại [ 108,74 (C- 12)], 02 methyl carbon bậc 4 tại [ 20,67 (C-13) và 22,07 (C-14)], 01 carbon không liên kết trực tiếp với hydro, có liên kết trực tiếp với oxy [ 76,59 (C-5)] và 01 methine carbon liên kết với oxy [ 69,87 (C-3)], 01 carbon bậc 4 tại [ 38,42 (C- 10)], 01 carbon bậc 3 liên kết với nhóm isopropenyl tại [ 42,80 (C-7)], 05 carbon bậc 2 tại [ 34,41 (C-1); 31,40 (C-2); 38,09 (C-6); 26,49 (C-8) và 33,55 (C-9). Với 15 carbon và các đặc điểm nêu trên, hợp chất có dạng sesquiterpene eudesmane [9]. Từ số liên kết đôi tương đương là 4, trừ đi 02 liên kết đôi đã được xác định nêu trên, suy ra trong phân tử có thêm hai vòng cyclohexane liên kết tại vị trí C-5 và C-10.

Tiếp tục phân tích tiếp các tương tác 1H-13C thu được từ việc phân tích phổ HSQC (hình 4.1.1d) của hợp chất 1, các số liệu thu được trình bày trên bảng 4.1

Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất 1 C Ca Cb,c Hb,d độ bội (J = Hz) HMBC (1H 13 C) 1 72,2 34,41 1,28 m/1,96 m 2 41,1 31,40 1,54 m/1,90 m 3 3 68,2 69,87 4,49 br d (11,0) 4 155,4 152,43 - 5 76,7 76,59 - 6 37,1 38,09 1,73 m/2,00 m 5, 7, 8, 10 7 40,7 42,80 2,33 m 8 27,1 26,49 1,55 m 9 31,3 33,55 1,10 m/1,67 m 10 43,2 38,42 - 11 151,8 149,25 - 12 109,0 108,74 4,72 br s/4,74 br s 7, 11, 13 13 21,2 20,67 1,67 s 7, 11, 12 14 13,5 22,07 1,06 s 1, 9, 10 15 105,6 107,90 5,15 br s/5,42 d (1.5) 3, 4, 5

Hình. 4.1.1d. Phổ HSQC của hợp chất 1

Các nghiên cứu của nhóm tác giả Thomas A. F và cộng sự [5] cho thấy đối với các hợp chất sesquiterpene eudesmane với hai vòng cyclohexane liên kết tại vị trí C-5 và C-10 ở kiểu trans thì độ chuyển dịch hóa học 13C của nhóm tert-methyl liên kết trực tiếp với carbon bậc 4 tại C-10 dịch chuyển về phía trường cao với C

<20 ppm, trong khi hiệu ứng của -gauche của nhóm hydroxy tại vị trí C-1 ở dạng  sẽ làm cho độ dịch chuyển 13C của nhóm tert-methyl liên kết trực tiếp với carbon

bậc 4 tại C-10 chuyển dịch về phía trường cao với giá trị  8,5 [5][ 27][ 31][ 35]. Đối với hợp chất 1, độ chuyển dịch hóa học 13

C của nhóm tert-methyl tại C-14 (

22,07), giá trị này phù hợp do trên hợp chất không còn nhóm hydroxy tại vị trí C-1, hiệu ứng -gauche của nhóm hydroxy đã không còn. Nhận định này cũng phù hợp khi so sánh số liệu phổ của hợp chất canusesnol E [16] độ chuyển dịch hóa học 13

C

của nhóm tert-methyl tại C-14 ( 13,5) với hai vòng cyclohexane liên kết tại vị trí C-5 và C-10 ở kiểu trans và hiệu ứng -gauche của nhóm hydroxy.

Tác giả Cocker W và cộng sự [9] đã chứng minh các hợp chất eudesmane sesquiterpene có nhóm isopropyl ở dạng equatorial đối với vòng cyclohexane. Đồng thời phân tích phổ NOESY (hình 4.1.1f) cho thấy tương tác giữa H-7 (H 2,33) với

H-9 (H 1,67). Do vậy proton H-7 sẽ cùng phía với nhóm thế tại vị trí C-5, sự thay đổi nhóm thế tại vị trí C-5 sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến độ chuyển dịch hóa học tại C- 7. Các hợp chất như canusesnol B, E có độ chuyển dịch hóa học của proton tại C-7 tương ứng là 1,84; 2,53 ppm [16], rõ ràng sự dịch chuyển về phía trường thấp là do nhóm thế cùng phía, trong trường hợp các chất canusesnol B, E thì nhóm thế tại C-5 là -hydroxyl.

Hình 4.1.1e. Phổ HMBC của hợp chất 1

Các phân tích trên phổ HMBC (hình4.1.1e) cho thấy: tương tác HMBC giữa proton H3-13 (H 1,67) với C-7 (C 42,80); C-11 (C 149,25); C-12 (C 108,74) và tương tác giữa proton H-12a (H 4,72)/ H-12b (H 4,74) với C-7 (C 42,80), C-11 (C 149,25) cho thấy sự có mặt của nhóm isopropenyl tại C-7. Tương tác giữa proton H3-14 (H 1,06) với C-1 (C 34,41); C-5 (C 76,59); C-9 (C 33,55) và C-10 (C 38,42) cho thấy nhóm methyl liên kết với carbon bậc 4 tại vị trí C-10 (C 38,42), sự có mặt của nhóm carbon không liên kết trực tiếp với hydro, liên kết trực tiếp với

Hình 4.1.1f. Phổ NOESY của hợp chất 1

Tương tác giữa proton H-15a (H 5,15)/ H-15b (H 5,42) với C-5 (C 76,59); C-3 (C 69,87) khẳng định sự có mặt nhóm oxygenated methine carbon tại C-3 (C 69,87). Tiếp tục phân tích các tương tác HMBC còn lại và so sánh độ chuyển dịch hóa học của các vị trí còn lại trên cấu trúc của hợp chất 1 với vị trí tương ứng trên cấu trúc canusesnol E [16], kết quả so sánh cho thấy sự khác biệt tại vị trí C-1 trên cấu trúc của hợp chất 1 so với canusesnol E, cụ thể độ chuyển dịch hóa học 13C của hợp chất 1 tại các vị trí C-1 (C 34,41) trong khi của canusesnol E tương ứng C-1 (C 72,2). Các vị trí khác còn lại là tương đương, ngoại trừ những vị trí bị ảnh hưởng bởi sự thay thế của nhóm hydroxy trên cấu trúc của canusesnol E bằng nhóm methylene trên cấu trúc của hợp chất 1. Độ chuyển dịch hóa học 13C tại C-3 (C

69,87); C-5 (C 76,59) và C-15 (C 107,9) của hợp chất 1 trong khi độ chuyển dịch hóa học 13C tại C-3 (C 68,2); C-5 (C 76,7) và C-15 (C 105,6) của canusesnol E có nhóm hydroxy tại C-3, C-5 ở dạng ,  [16], độ chuyển dịch hóa học 13C tại C-3 (C

trihydroxyeudesma-4(15), 11-dien) có nhóm hydroxy tại C-3, C-5 ở dạng  [33]. Đồng thời với hằng số tương tác của proton H-3 ở dạng broad doublet với J=11,0 Hz, cho thấy hằng số tương tác lớn giữa proton H-3 (H 4,49) với H-2 (H 1,54). Phân tích phổ NOESY (hình 4.1.1f) cho thấy tương tác yếu giữa H-3 (H 4,49) với H-2 (H 1,90), tương tác rõ giữa H3-14 (H 1,06) với H-2 (H 1,54) cho phép khẳng định proton H-3 ở vị trí , nhóm hydroxy tại C-3 ở dạng . Dựa trên các số liệu và các lập luận nêu trên, hợp chất 1 đã được xác định, đây là hợp chất mới và được đặt tên là 3, 5-dihydroxyeudesma-4(15),11-diene (hình 4.1.1g).

Hình 4.1.1g. Các tương tác HMBC chính và cấu trúc hóa học của hợp chất 1

4.1.2. Hợp chất 2: 4(15)-Eudesmene-1β,6α-diol

Hợp chất 2 được phân lập dưới dạng dầu, không màu. Trên phổ 1H-NMR (hình 4.1.2a) xuất hiện các tín hiệu của 03 nhóm methyl tại H 0,71; 0,87 và 0,96. Phổ 13C-NMR (hình 4.1.2a) xuất hiện tín hiệu của 15 carbon bao gồm 05 methine carbon, 04 carbon methylene lai hóa sp3, 01 exomethylene carbon, 03 methyl carbon và 02 carbon bậc 4. Phân tích các tương tác 1H-13C thu được từ việc phân tích phổ HSQC (hình 4.1.2c) của hợp chất 2 cho thấy các tín hiệu cộng hưởng của proton H 0,87 (H3-12) với C 16,22 (C-12), giữa proton H 0,96 (H3-13) với C 21,1 (C-13) và giữa proton H 2,24 (H-11) với C 26,05 (C-11), cùng với hằng số tương tác tại H3-12 và H3-13 ở dạng doublet và độ chuyển dịch hóa học của các vị trí này cho thấy sự có mặt của nhóm isopropryl. Phân tích tiếp các tín hiệu cộng hưởng

giữa proton H 0,71 (H3-14) với C 11,6 (C-14) cùng với hằng số tương tác ở dạng singlet có thể nhận dạng đây là nhóm tert-methyl. Các tín hiệu cộng hưởng giữa proton H 4,75 (H-15a) và 5,02 (H-15b) với C 107,82 cùng với sự có mặt của carbon bậc 4 tại C 146,26 (C-4) cho thấy sự có mặt của liên kết đôi ngoại vòng,

tương ứng với sự có mặt của nhóm exomethylen trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton. Tín hiệu cộng hưởng giữa proton H 3,43 với C 79,06 (C-1), giữa proton

H 3,72 với C 67,04 (C-6) cho thấy sự có mặt của methin carbon có liên kết trực tiếp với oxy, xác định sự có mặt của 02 nhóm oxymethine trong phân tử.

Hình 4.1.2a. Phổ 1

H-NMR của hợp chất 2

Hình 4.1.2b. Phổ 13

Hình 4.1.2c. Phổ HSQC của hợp chất 2

Tiếp tục phân tích tiếp các tương tác 1H-13C thu được từ việc phân tích phổ HSQC (hình 4.1.2c) của hợp chất 2, các số liệu thu được trình bày trong bảng 4.2

Bảng 4.2 Số liệu phổ NMR của hợp chất 2 C aC Cb,c Hb,d dạng pic (J = Hz) HMBC (1H 13C) 1 79,0 79,06 3,43 dd (4,5; 11,5) 2 31,9 31,95 1,55 m/1,85 m 3 35,1 35,12 2,07 dt (5,5; 13,5) 2,33 ddd (2,0; 5,0; 13,5) 4 146,2 146,26 -