Trong thí nghiệm này chúng tôi thực hiện thụ tinh ống nghiệm với tinh trùng đƣợc bảo quản lạnh -196o
C trong cọng rạ. Trứng sau khi nuôi 44-46h, có thể dùng để IVF
Các loại môi trƣờng sử dụng trong thụ tinh ống nghiệm (IVF) FM: Môi trƣờng dùng để pha loãng và thụ tinh
TCM 199 pH 7,8 : Môi trƣờng hoạt hóa tinh, kiện toàn năng lực thụ tinh IVC PyrLac: Môi trƣờng nuôi phôi trong 2 ngày đầu
IVC Glucose: Môi trƣờng nuôi phôi đến ngày thứ 6
Ngày thụ tinh đƣợc coi là ngày 0.
Môi trƣờng thụ tinh là môi trƣờng Pig-FM cải biên có bổ sung 2mM Caffein anhydrous và 5mg/ bovine serum albumin (BSA; Fraction V, Sigma). Kỹ thuật IVF đƣợc làm theo phƣơng pháp của Kikuchi vcs., 2002 [28]
Các bƣớc thực hiện gồm
Chuẩn bị các loại môi trƣờng Chuẩn bị trứng
Chuẩn bị tinh
Thụ tinh ống nghiệm Nuôi phôi
Chuẩn bị môi trƣờng :
Các loại môi trƣờng dùng trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn:
Môi trƣờng thụ tinh (FM). Dùng để pha loãng tinh và ủ trứng với tinh trùng.
Môi trƣờng hoạt hóa, kiện toàn năng lực thụ tinh : TCM 199 pH 7,8
Môi trƣờng nuôi phôi ở ngày thứ 0 đến ngày thứ 2 (IVC Pyrlac). Ngày thụ tinh đƣợc tính là ngày 0.
Môi trƣờng nuôi phôi ở ngày thứ 2 đến thứ 6 (IVC Gluco)
Môi trƣờng thụ tinh: Đƣợc nạp vào đĩa tròn 7 giọt mỗi giọt 40l cách đều nhau, sau đó phủ dầu lên bề mặt các giọt môi trƣờng thụ tinh cho kín rồi thêm vào mỗi giọt 45l môi trƣờng thụ tinh rồi lại phủ dầu parafin (Paraffin lỏng, Nakarai Tesque, Kyoto, Nhật Bản) lên tiếp cho kín các giọt.
Môi tƣờng hoạt hóa tinh: Môi trƣờng TCM 199 có pH 7,8
Môi trƣờng pha loãng tinh: Môi trƣờng FM đƣợc nạp trong đĩa 4 giếng Môi trƣờng nuôi phôi: Môi trƣờng IVC pyrlac đƣợc nạp vào đĩa 4 giếng, mỗi giếng 500l.
Các môi trƣờng đã chuẩn bị đƣợc đƣa vào tủ ấm ít nhất 2 giờ trƣớc khi thụ tinh.
Chuẩn bị trứng: Trứng lợn sau khi nuôi thành thục 44h đến 46h sẽ tách tế bào cumulus bằng men hyalronidaz (một loại men của tinh trùng tiết ra để pha vỡ tế bào cumulus) để cho trứng đỡ dính với nhau. Sau đó đƣợc rửa lại 2 - 3 lần với môi trƣờng thụ tinh (FM) trƣớc khi đƣa vào môi trƣờng thụ tinh chính thức với mục đích làm cho sạch men hyaluroindaz và giúp cho trứng làm quen dần với môi trƣờng mới. Sau đó trứng đƣợc đƣa vào các giọt thụ tinh với mật độ không quá 20 tế bào trứng/giọt.
Chuẩn bị tinh trùng: Tinh cọng rạ bảo quản trong nitơ lỏng -196oC đƣợc giải đông trong nƣớc ấm 37oC dƣới 1 phút. Tinh trùng đƣợc đƣa vào môi trƣờng hoạt hóa tinh trùng TCM - 199, pH 7,8 và lấy 1 giọt tinh trùng ra soi kính hiển vi kiểm tra xem hoạt động của tinh trùng, nếu hoạt động thì đem ly tâm ở 2000 vòng/ phút trong 2 phút. Tiếp theo hút bỏ phần dung dịch trong phía trên lấy phần cặn ở dƣới đáy chứa tinh trùng. Sau đó thêm môi trƣờng TCM-TCM 199, pH 7,8 khoảng 60l đến 100µl vào để pha loãng, sục đều và lấy ra 10l tinh pha với 2 ml NaCl 3% để đếm tinh bằng phƣơng pháp đếm dùng buồng đếm hồng cầu. Phần tinh còn lại cho vào đĩa tròn, phủ dầu ấm đƣa ngay vào trong tủ ấm 38,5oC trong 15 phút.
Tính toán nồng độ tinh
Dựa vào tổng số tinh trùng đếm đƣợc trong 4 ô vuông nhỏ trong buồng đếm mà ta tính toán đƣợc nồng độ tinh phù hợp. Trong thí nghiệm, chúng tôi sử dụng 3 nồng độ tinh là 0,05 triệu, 0,1 triệu hoặc 1 triệu tinh trùng/ml (tt/ml)
Sau khoảng 15 phút trong tủ ấm. Lúc này tinh trùng đã sẵn sàng cho thụ tinh. Khi kiểm tra đánh giá chất lƣợng tinh trùng dựa trên các chỉ tiêu nhƣ: hoạt lực tinh trùng, sức sống của tinh trùng, nồng độ tinh trùng
Tiến hành thụ tinh ống nghiệm:
Sau khi tinh trùng đƣợc hoạt hóa và đánh giá chất lƣợng, chúng tôi tiến hành cho trứng tiếp xúc tinh trùng trong giọt thụ tinh (thụ tinh ống nghiệm)
Dùng pipet lấy lƣợng tinh đã tính toán theo nồng độ đƣa vào các giọt thụ tinh. Dùng pipet sục nhẹ để trộn đều tinh trùng và trứng. Nhanh chóng đƣa đĩa chứa môi trƣờng thụ tinh vào tủ 38,5oC trong điều kiện không khí 5% O2, 5% CO2 và N2 90%, độ ẩm bão hòa.
Toàn bộ quá trình đƣợc thực hiện trên bàn ấm, hạn chế ánh sáng và trong điều kiện vô trùng.
Tinh trùng đƣợc ủ với trứng trong khoảng thời gian 3 giờ
Nuôi phôi
Sau thời gian trứng ủ với tinh trùng, Trứng đƣợc tách sạch lớp tế bào cận noãn và các tinh trùng bám xung quanh. Trứng đƣợc rửa lại 2-3 lần và chuyển vào nuôi trong đĩa 4 giếng chứa môi trƣờng nuôi phôi trong 2 ngày đầu là môi trƣờng IVC pyrlac (NCSU-37 có chứa 4 mg/ BSA và 50μM β-mercaptoethanol). Ở ngày thứ 2 (46-48 h sau thụ tinh), phôi giả định đƣợc đánh giá khả năng phân chia và chuyển sang môi trƣờng IVC bổ sung thêm 5,55 mM D-glucose (Sigma) hay còn gọi là môi trƣờng IVC glucose trong vòng bốn ngày sau. Toàn bộ quá trình nuôi phôi trong điều kiện 38,5o
C, 5% O2, 5% CO2 và N2 90%, độ ẩm bão hòa.
Để đánh giá tình trạng thụ tinh của tế bào trứng ở giai đoạn phân bào giảm nhiễm, hợp tử và khả năng phát triển của phôi sau khi thụ tinh ống nghiệm và sau đó tiến hành nuôi cấy trong ống nghiệm (IVC), tế bào trứng sau khi nuôi thành thục trong khoảng 44 - 46giờ, hợp tử đƣợc hình thành sau 8-10 giờ cho
tinh vào môi trƣờng có trứng (dẫn tinh), phôi hình thành sau khi nuôi trong môi trƣờng IVC 2 ngày và phôi nang (blastocysts) đƣợc hình thành sau khi nuôi trong môi trƣờng IVC 6 ngày. Vì vậy, tình trạng thụ tinh của trứng đƣợc đánh giá ở thời điểm 10 giờ sau thụ tinh và 6 ngày sau thụ tinh (tính từ lúc cho tinh trùng gặp trứng). Bằng cách tiến hành ép trứng vào phiến kính và đậy lamen lên sau đó tiêu bản đƣợc cố định trong một hỗn hợp của axit acetic và ethanol với tỉ lệ 1:3 về thể tích, ít nhất trong 3 ngày. Sau đó đƣợc nhuộm màu với aceto- orcein trong vòng 5-7 phút và rửa với dung dịch aceto-glycerol (acid acetic : glycerol : cất nƣớc với tỉ lệ 1: 1: 3). Sau đó đƣợc kiểm tra trên kính hiển vi tƣơng phản pha (Olympus, Tokyo, Nhật Bản) với độ phóng đại 40X và 100X. Tế bào trứng đã đƣợc đánh giá về sự trƣởng thành đến gian kỳ phân chia phân bào giảm nhiễm thứ hai (M-II), và giả định hợp tử đƣợc đánh giá cho các thông số thụ tinh nhƣ: tỷ lệ hình thành tiền nhân đực (MPN), tỷ lệ đơn tinh trùng, thụ tinh bình thƣờng, đối với phôi thai vào ngày 2 và ngày 6 (ngày thụ tinh định nghĩa là ngày 0) đƣợc đánh giá về tỷ lệ trứng phân chia và tỷ lệ phôi nang hình thành