Nuôi thành thục trứng lợn là bƣớc khởi đầu cho các nghiên cứu tiếp theo nhƣ thụ tinh ống nghiệm, nhân bản vô tính…Đây là bƣớc cung cấp nguồn nguyên liệu tế bào trứng thành thục. Trứng lợn đƣợc thu từ các nang có kích thƣớc từ 2-6mm trên bề mặt buồng trứng. Trứng sau thu đƣợc phân loại chất lƣợng, chỉ có trứng có trên hai lớp tế bào cận noãn mới đƣợc đƣa vào sử dụng. Môi trƣờng nuôi thành thục là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng tới khả năng thành thục cũng nhƣ sự phát triển tiếp theo của tế bào trứng lợn sau thụ tinh ống nghiệm [36, 53]. Đã có nhiều loại môi trƣờng đƣợc sử dụng thành công trong nuôi thành thục tế bào trứng lợn. Việc lựa chọn môi trƣờng nuôi thành thục tối ƣu giúp nâng cao hiệu quả thụ tinh ống nghiệm.
Ba loại môi trƣờng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này là NCSU-37 có chứa 10% dịch nang trứng lợn, TCM 199 bổ sung 10% huyết thanh thai bò (FBS) và TCM 199 bổ sung 10% dịch nang trứng lợn (pFF). Cả ba loại môi trƣờng này đều đƣợc bổ sung các chất cần thiết cho sự thành thục tế bào trứng lợn nhƣ cystein, β-mercaptoethanol, hormone.
Sau 44 giờ đến 46 giờ nuôi trong môi trƣờng nuôi thành thục, tế bào trứng lợn đƣợc đánh giá khả năng thành thục theo phƣơng pháp nhuộm nhân (mục 3.4.4). Kết quả đánh giá trạng thái nhân của tế bào trứng lợn đƣợc thể hiện trong bảng 4.1
Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới khả năng thành thục của tế bào trứng lợn Môi trƣờng Số trứng TN Giai đoạn GV/GVBD (%) Giai đoạn gian kỳ 1 – MI (%) Giai đoạn gian kỳ 2 - MII (%) Các trạng thái khác (%)
NCSU-37 (đối chứng). 158 6 (3,8 ± 0,6)b 14 (8,9 ± 3,1)b 129 (81,6 ± 3,4)a 9 (5,7 ± 1,6)a TCM 199 10% FBS 94 13 (13,8 ± 5,1)a 19 (20,2 ± 3,0)a 57 (60,6 ± 3,9)c 5 (5,3 ± 2,9)a TCM 199 10% pFF 78 7 (9,0 ± 2,3)a 15 (19,2 ± 5,1)a 54 (69,2 ± 4,5)b 2 (2,6 ± 1,4)b
Thí nghiệm được lặp lại 5 lần.
Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, P<0,05.
Qua bảng ta thấy, trứng lợn khi nuôi thành thục trong ống nghiệm sẽ phát triển qua các giai đoạn từ GV (bóng mầm), tan bóng mầm (GVBD), gian kỳ I (metaphase I) rồi đến gian kỳ II (metaphase II, thành thục). Tỷ lệ trứng ở giai đoạn GV/GVBD của môi trƣờng NCSU 37, TCM 199 10% FBS, TCM 199 10% pFF lần lƣợt là (3,8 ± 0,6%, 13,8 ± 5,1% và 9,0 ± 2,3%). Nhƣ vậy, khi nuôi trứng trong môi trƣờng TCM 199 10% FBS và TCM 199 10% pFF tỷ lệ trứng ở giai đoạn GV/GVBD cao hơn so với khi nuôi trong môi trƣờng NCSU 37 (P<0,05). Tỷ lệ trứng ở giai đoạn GV/GVBD khi nuôi trong môi trƣờng TCM 199 10% FBS cao hơn so với môi trƣờng TCM 199 10% pFF. Tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P>0,05)
Hình 4.1 Trứng lợn ở giai đoạn GV (a) và giai đoạn MI. Mũi tên chỉ trạng thái nhân của tế bào trứng.
Kết quả tƣơng tự với giai đoạn MI, tỷ lệ trứng ở giai đoạn MI trong ba loại môi trƣờng NCSU, TCM 199 10% FBS, TCM 199 10% pFF lần lƣợt là (8,9 ± 3,1%, 20,2 ± 3,0%, 19,2 ± 5,1%). Tỷ lệ trứng ở giai đoạn MI trong hai môi trƣờng TCM 199 là tƣơng đƣơng nhau và cao hơn có ý nghĩa (P<0,05) so với khi nuôi trong môi trƣờng NCSU 37.
Trứng ở giai đoạn gian kỳ hai là chỉ tiêu chúng tôi quan tâm nghiên cứu. Vì chỉ có trứng ở giai đoạn gian kỳ II (thành thục) mới có khả năng tham gia thụ tinh và tạo phôi. Khi trứng phát triển chƣa tới, hoặc qua giai đoạn này thì không có khả năng thụ tinh nữa.
Trứng nuôi trong môi trƣờng NCSU 37 cho tỷ lệ phát triển đến giai đoạn MII đạt 81,6 ± 3,4% cao hơn có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với khi nuôi trong môi trƣờng TCM 199 10% pFF và môi trƣờng TCM 199 10% FBS lần lƣợt là 69,2 ± 4,5% và 60,6 ± 3,9%. Trong đó, môi trƣờng có bổ sung dịch nang trứng lợn (pFF) cho tỷ lệ thành thục cao hơn so với môi trƣờng bổ sung huyết thanh thai bò (FBS) (P<0,05). Tỷ lệ thành thục của môi trƣờng TCM 199 10% pFF cao hơn so với môi trƣờng TCM 199 10% FBS có thể giải thích là do pFF đƣợc tạo ra từ các chất tiết nang, những chất này hỗ trợ tế bào trứng thành thục trong cơ thể. Dịch nang trứng (pFF) đƣợc chứng minh là tác dụng dƣơng tính đối với sự thành thục nhân và tế bào chất (Yoshida vcs., 1992) [55].
Môi trƣờng NCSU 37, có bổ sung pFF nhƣng nuôi thành hai giai đoạn: Giai đoạn 1 có bổ sung hormone và dbcAMP, giai đoạn 2 không bổ sung gì cả. Môi trƣờng TCM 199 10% FBS và TCM 199 10% pFF không có bổ sung dbc AMP. Vì dbcAMP có tác dụng ức chế quá trình phân chia nhân trứng trong 24
giờ đầu của IVM, vậy nên tạo thêm thời gian cho noãn bào chất có thể thành thục đầy đủ hơn. Có thể do nguyên nhân này mà tỷ lệ thành thục của tế bào trứng ở nhóm thí nghiệm bổ sung huyết thanh thai bò (FBS) và dịch nang trứng (pFF) thấp hơn so với đối chứng. Nhƣng hai phƣơng pháp này lại có ƣu điểm là không phải thay môi trƣờng nuôi sau 22-24 giờ nên tránh đƣợc hiện tƣợng nhiễm khuẩn trong quá trình nuôi trứng. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới khả năng thành thục của tế bào trứng lợn đã đƣợc nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu. Các môi trƣờng nuôi thành thục nói chung đều đƣợc bổ sung các chất cần thiết cho sự thành thục của tế bào trứng lợn [53, 56].
Hình 4.2 a-Trứng lợn ở giai đoạn thành thục (mũi tên đen – nhân của thể cực, mũi tên trắng – nhân của tế bào trứng). 4.2 b – Trứng lợn thành thục với sự xuất
hiện của thể cực thứ nhất (mũi tên)
Wang vcs., 1997 [53] đã nghiên cứu ảnh hƣởng của ba loại môi trƣờng nuôi là TCM 199, NCSU 23 và mWM tới khả năng thành thục của tế bào trứng lợn . Cả ba loại môi trƣờng này đều bổ sung 0,57mmol cystein/l và 10% dịch nang trứng. Ngoài ra, môi trƣờng mWM có bổ sung thêm 25,2mmol/l natri lactate, natri pyruvat (0,33 mmol/l, canxi lactate 1,71 mmol/l. Môi trƣờng NCSU 23 bổ sung taurine (7mmol/l), hypotaurine (5mmol/l), glutamine (1mmol/l). Môi
trƣờng TCM 199 chỉ bổ sung glutamine 0,68 mmol/l. Kết quả về tỷ lệ thành thục cho thấy không có sự khác biệt về tỷ lệ thành thục giữa các loại môi trƣờng nuôi. Tỷ lệ thành thục ở các loại môi trƣờng tƣơng ứng là 87%, 93%, 89%. Kết quả này cao hơn so với tỷ lệ thành thục khi nuôi trong các loại môi trƣờng của chúng tôi. Điều này có thể giải thích là do nhiều nguyên nhân khác nhau ảnh hƣởng đến chất lƣợng trứng in vitro: Nguồn mẫu, thời điểm thu mẫu, điều kiện bảo quản, cơ sở vật chất phòng thí nghiệm. Nguồn mẫu thƣờng là giống lợn lai nuôi để giết thịt, bổ sung thức ăn tăng trọng nhanh, tuổi giết thịt là 4-5 tháng khi chƣa thành thục về tính. Bên cạnh đó chất lƣợng của các lô lợn từ các cơ sở chăn nuôi khác nhau cũng rất khác nhau chứ không đồng đều nhƣ lợn đƣợc nuôi công nghiệp bên các nƣớc phát triển.
Tuy nhiên, tỷ lệ thành thục theo tiêu chí đạt đến giai đoạn MII không phải là tiêu chí duy nhất đánh giá một hệ thống nuôi thành thục, bởi bên cạnh đó khả năng thụ tinh, hình thành các tiền nhân và phát triển của phôi sau IVF cũng là những tiêu chí rất quan trọng. Kết quả về ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới tỷ lệ thụ tinh của tế bào trứng lợn đƣợc thể hiện ở mục 4.2