tinh ống nghiệm
Đa tinh trùng đƣợc xem là một trong những vấn để khó và dai dẳng nhất cần khắc phục trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn [10, 16]. Đã có nhiều nghiên cứu đánh giá nồng độ tinh trùng sử dụng trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn, từ đó tối ƣu hóa nồng độ tinh, tạo hiệu quả cao trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn. Bên cạnh yếu tố tinh trùng, chất lƣợng trứng cũng là một trong những yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng thành thục (Karja, 2008) [24] và khả năng thụ tinh của tế bào trứng lợn thụ tinh ống nghiệm (Suzuki vcs., 2003) [51]. Vì thế, trong nghiên cứu này chúng tôi cũng đánh giá ảnh hƣởng của nồng độ tinh và chất lƣợng trứng tới khả năng thụ tinh và sự phát triển tiếp theo của tế bào trứng lợn.
4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới kết quả thụ tinh trong ống nghiệm ở lợn lợn
Tế bào trứng lợn đƣợc nuôi thành thục trong môi trƣờng TCM 199 bổ sung 10% FBS trong 44-46h, trứng đƣợc đƣợc thụ tinh với tinh trùng đông lạnh – giải đông trong thời gian 3 giờ ở các mức nồng độ là 0,05 triệu tt/ml, 0,1 triệu tt/ml và 1 triệu tt/ml. Sau thụ tinh 10 giờ, trứng đƣợc cố định trong dung dịch ethanol:acid acetic (3:1) theo tỷ lệ về thể tích (v/v) để đánh giá kết quả thụ tinh.
Các chỉ tiêu nghiên cứu là tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng, tỷ lệ hình thành tiền nhân đực và tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng của tế bào trứng với trứng thuộc các nhóm phân theo chất lƣợng trứng là A, B1, B2. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 4.4-4.6. Để đánh giá ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới khả năng xâm nhập của tinh trùng vào tế bào trứng, mỗi nhóm chất lƣợng trứng chúng tôi cho thụ tinh với tinh trùng ở ba mức nồng độ tăng dần là 0,05 triệu tt/ml, 0,1 triệu tt/ml, 1
triệu tt/ml. Kết quả cho thấy, khi tăng mức nồng độ tinh thì tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng vào tế bào trứng tăng lên. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 4.4
Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới khả năng thụ tinh của tinh trùng với trứng loại A Nồng độ tinh (tt/ml) Số trứng TN Tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng (%) Tỷ lệ hình thành tiền nhân (%) Tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng (%) 0,05 triệu 97 35 (36,2 ± 2,6)b 21 (60,6 ± 3,2)b 15 (43,1 ± 4,5)b 0,1 triệu 98 59 (60,3 ± 1,9)a 50 (85,1 ± 3,7)a 38 (64,3 ± 3,3)a 1 triệu 113 80 (70,8 ± 1,4)a 56(69,9 ±1,6)b 33 (41,4± 1,7)b
Thí nghiệm được lặp lại 5 lần.
Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, P<0,05.
Đối với trứng lợn loại A, tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng vào trứng ở mức nồng độ 0,05 triệu tt/ml là thấp nhất 36,2 ± 2,6%. Khi tăng nồng độ tinh lên 0,1 triệu tt/ml, tỷ lệ này đạt 60,3 ± 1,9%, sự khác biệt này có ý nghĩa với P<0,05. Tiếp tục tăng nồng độ tinh lên mức 1 triệu tt/ml, tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng tăng lên mức 70,8 ± 1,4%. Tỷ lệ hình thành tiền nhân là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá khả năng thụ tinh của trứng và tinh trùng. Tỷ lệ hình thành tiền nhân đạt cao nhất ở mức nồng độ 0,1 triệu tt/ml là 85,1 ± 3,7% cao hơn so với mức nồng độ 0,05 triệu tt/ml và 1 triệu tt/ml lần lƣợt là (60,6 ± 3,17% và 69,9 ±1,6%), sự khác biệt có ý nghĩa với P<0,05. Tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng ở mức nồng độ 0,05 triệu tt/ml và 1 triệu tt/ml không có sự khác biệt, lần lƣợt là 43,1 ± 4,5% và 41,4 ± 1,7% với P>0,05 và thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với mức nồng độ 0,1 triệu tt/ml tƣơng ứng là 64,3± 3,3% (P<0,05).
Cũng nghiên cứu về ảnh hƣởng của nồng độ tinh, tác giả Zăhan vcs., 2006 (Zăham vcs., 2006) [57] đã chỉ ra rằng khi tăng nồng độ tinh từ 5 x 0,1 triệu lên 7,5 x 0,1 triệu - 1 triệutinh trùng/ml thì tổng tỷ lệ thụ tinh tăng từ 37,93% lên đến 41,94%. Tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng này là tƣơng đƣơng so với kết quả của chúng tôi ở nồng độ 0,05 triệu tt/ml, 1 triệu tt/ml. Trong khi đó, nồng độ tinh 5 x 0,1 triệu, tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng của chúng tôi đạt 64,3 ± 3,3%. Nhƣng nếu tiếp tục tăng nồng độ tinh lên mức 2,5 x 1 triệu tinh trùng/ml thì tỷ lệ thụ tinh giảm xuống còn 38,71%. Nếu tăng nồng độ tinh lên 5 x 1 triệu tinh trùng/ml thì tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng giảm xuống còn 27,54%, đồng thời với việc tăng hiện tƣợng đa tinh trùng (Zăham vcs., 2006) [57].
Qua đó ta thấy việc đánh giá nồng độ tinh là rất quan trọng trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn. Nếu nồng độ tinh thấp quá, khả năng xâm nhập, thụ tinh của tinh trùng kém. Nhƣng nếu nồng độ tinh quá cao sẽ dẫn đến hiện tƣợng đa tinh trùng. Vì vậy, việc đánh giá nồng độ tinh là cần thiết trong thụ tinh ống nghiệm nói chung, thụ tinh ống nghiệm ở lợn nói riêng.
Việc giảm tỷ lệ tinh trùng:trứng trong quá trình thụ tinh cũng góp phần cải thiện tỷ lệ thụ tinh và sự phát triển bình thƣờng của phôi thụ tinh ống nghiệm (Sasithorn vcs., 2011) [48]. Ba tỷ lệ tinh trùng: trứng đƣợc sử dụng là (1000:1, 2000:1, 4000:1). Tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng tăng khi trứng đƣợc thụ tinh ở mức tỷ lệ 2000 (90.23±2,5%) và 4000 (93.46±3,7%) so với ở mức tỷ lệ 1000:1 là (74,08±1,2%). Trứng đƣợc thụ tinh ở mức tỷ lệ 1000:1 có tỷ lệ đơn tinh cao hơn (81,79±2,9%) so với những trứng đƣợc thụ tinh ở mức 2000:1 và 4000:1 tƣơng ứng là (48,07±6,0 và 31,51±4.9%, theo thứ tự). Khả năng phát triển đến giai đoạn phôi nang tăng có ý nghĩa trong nhóm 1000:1 (29,02±1.8%) so với tỷ lệ này ở nhóm 4000:1 (14,00±3,0%). Tuy nhiên không có sự khác biệt về số lƣợng tế bào trong mỗi phôi nang nhƣng phôi nang tạo ra từ nhóm tỷ lệ 1000:1 có số tế bào nội phôi nhiều nhất. Kết quả nghiên cứu của Sasithorn vcs., 2011
[48] chỉ ra rằng, tỷ lệ tinh trùng:trứng tối ƣu ở thời điểm thụ tinh cải thiện tỷ lệ thụ tinh đặc biệt là tỷ lệ đơn tinh trùng và tỷ lệ hình thành phôi nang. Điều này một lần nữa khẳng định vai trò của việc lựa chọn nồng độ tinh phù hợp trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn
Hình 4.3-a Tế bào trứng lợn thụ tinh bình thƣờng (mũi tên chỉ một tiền nhân đực và một tiền nhân cái), 4.3-b Tế bào trứng lợn đa thụ tinh
Hình 4.3-a minh họa tế bào trứng lợn thụ tinh bình thƣờng với hình thành một tiền nhân đực (mũi tên đen) và một tiền nhân cái (mũi tên đỏ). Trứng trứng này có khả năng phát triển đến giai đoạn phôi nang và có thể phát triển đến giai đoạn con non. Trong khi đó, tế bào trứng lợn đa thụ tinh (Hình 4.3-b) có ba tiền nhân (trong đó có hai tiền nhân đực). Những trứng này ít có khả năng phát triển đến giai đoạn phôi nang và gần nhƣ không có khả năng phát triển thành lợn con.
Chúng tôi tiếp tục đánh giá ảnh hƣởng của nồng độ tinh đối với trứng lợn loại B tới khả năng thụ tinh của vào tế bào trứng lợn. Kết quả thể hiện ở bảng 4.5
Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới khả năng thụ tinh của tinh trùng với trứng loại B1
Nồng độ tinh (tt/ml) Số trứng TN Tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng (%) Tỷ lệ hình thành tiền nhân (%) Tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng (%) 0,05 triệu 109 32 (29,4 ± 1,3)c 18 (56,2 ± 3,1)b 13(40,5 ± 3,2)b 0,1 triệu 99 50 (50,7 ± 4,1)b 39 (78,6 ± 2,5)a 29 (59,4 ± 5,4)a 1 triệu 111 74 (66,6 h 1,1)a 47(63,4 ± 2,1)b 28 (37,9 ± 1,7)b
Thí nghiệm được lặp lại 5 lần.
Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, P<0,05.
Tƣơng tự nhƣ đối với trứng A, trứng loại B1 cho tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng tăng khi tăng nồng độ tinh. Ở mức nồng độ 0,05 triệu tt/ml, tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng là 29,4 ± 1,3%. Khi tăng nồng độ tinh lên mức 0,1 triệu tt/ml, 1 triệu tt/ml, tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng cũng tăng lên tƣơng ứng là (50,7 ± 4,1%, 66,6 ± 1,1%), các sự khác biệt là có ý nghĩa thống kê với P<0,05. Trong khi đó, tỷ lệ hình thành tiền nhân đực ở nhóm nồng độ 0,1 triệu tt/ml là cao nhất, đạt 78,6 ± 2,5%, cao hơn có ý nghĩa so với tỷ lệ hình thành tiền nhân đực ở nhóm nồng độ 0,05 triệu tt/ml, 1 triệu tt/ml tƣơng ứng là (56,2 ± 3,1% và 63,4 ± 2,1%) P<0,05. Không có sự khác biệt trong sự hình thành tiền nhân ở mức nồng độ 0,05 triệu tt/ml và 1 triệu tt/ml. Tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng của nhóm nồng độ tinh 0,05 triệu tt/ml và 1 triệu tt/ml tƣơng ứng là 40,5 ± 3,2% và 37,9 ± 1,7% thấp hơn có ý nghĩa so với tỷ lệ hình thành tiền nhân đực ở mức nồng độ tinh 0,1 triệu tt/ml, tƣơng ứng là 59,4 ± 5,4% (P<0,05).
Tƣơng quan giữa thời gian ủ tinh với tinh trùng và nồng độ tinh cũng là yếu tố ảnh hƣởng tới kết quả thụ tinh ống nghiệm ở lợn (Abeydeera vcs., 1997). Trứng đƣợc ủ với tinh trùng trong vòng 12 giờ. Với nồng độ tinh 0,1 triệu tt/ml tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng đạt 39,9 ± 5,2%, kết quả này thấp hơn kết quả của
chúng tôi là 50,7 ± 4,1% với cùng nồng độ và thời gian ủ trứng với tinh trùng là 3 giờ. Tuy nhiên, khi tác giả tăng nồng độ tinh lên 5 x 0,1 triệu tt/ml và 1 triệu tt/ml làm tăng tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng vào trứng lên 83,5 ± 4,3% và 86,9 ± 3,1% (P<0,05). Không có sự khác biệt về tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng ở hai nồng độ tinh 5 x 0,1 triệu và 1 triệutt/ml. Kết quả này cao hơn kết quả của chúng tôi là 66,6 ± 1,1% với trứng loại B1 và 70,8 ± 1,4% với trứng loại A. Điều này có thể lý giải do sự khác biệt về thời gian ủ tinh, nguồn gốc, chất lƣợng của các lô tinh sử dụng.
Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới khả năng thụ tinh của tinh trùng với trứng loại B2 Nồng độ tinh (tt/ml) Số trứng TN Tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng (%) Tỷ lệ hình thành tiền nhân (%) Tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng (%) 0,05 triệu 115 26 (22,3 ± 1,7)c 10 (38,7 ± 5,6)b 5 (19,00 ± 5,5) 0,1 triệu 110 35 (31,6 ± 2,3)b 18 (51,9 ± 3,9)a 9 (25,5 ± 4,3) 1 triệu 120 52 (43,5 ± 2,0)a 30 (56,8 ± 5,2)a 8 (15,7 ± 2,8)
Thí nghiệm được lặp lại 5 lần.
Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, P<0,05.
Đối với trứng lợn loại B2, ở mức nồng độ tinh 0,05 triệu tt/ml, tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng là 22,3 ± 1,7%. Tăng mức nồng độ tinh lên 0,1 triệu tt/ml, 1 triệu tt/ml tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng là 31,6 ± 2,3%, 43,5 ± 2,0, sự khác biệt có ý nghĩa với P<0,05. Tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng ở hai mức nồng độ 0,1 triệu tt/ml và 1 triệu tt/ml cũng có sự khác biệt với P<0,05. Tỷ lệ hình thành tiền nhân của trứng khi thụ tinh ở mức nồng độ 1 triệu tt/ml là cao nhất 56,8 ± 5,2%
0,05 triệu tt/ml tƣơng ứng là (38,7 ± 5,6%). Không có sự khác biệt trong tỷ lệ hình thành tiền nhân của hai nhóm nồng độ 0,1 triệu tt/ml và 1 triệu tt/ml (P>0,05). Sự khác biệt về tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng của hai nhóm nồng độ này cũng có ý nghĩa với P<0,05. Tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng của mức nồng độ tinh 0,1 triệu tt/ml, 0,05 triệu tt/ml, 1 triệu tt/ml tƣơng ứng là (25,5 ± 4,3%, 19,00 ± 5,5% và 15,4 ± 2,8%). Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P>0,05.
Trứng đƣợc ủ với tinh trùng ở nồng độ 5 x 0,1 triệu tt/ml ở các mức thời gian là 3, 6, 9 và 12h. Ở thời điểm 3h sau thụ tinh, 31,1 ± 2,1% tế bào trứng đƣợc tinh trùng xâm nhập (Abeydeera và Day, 1997) [11]. Kết quả này tƣơng đƣơng với kết quả của chúng tôi về tỷ lệ tinh trùng xâm nhập là 31,6 ± 2,3% với trứng thuộc loại B2 và nồng độ tinh là 0,1 triệu tt/ml. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng xâm nhập của tinh trùng đƣợc thể hiện ở biểu đồ 4.1.
Biểu đồ 4.1. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng xâm nhập của tinh trùng
Qua biểu đồ 4.1 ta thấy, ở các mức nồng độ tinh khác nhau, chất lƣợng trứng cũng ảnh hƣởng tới khả năng xâm nhập của tinh trùng sau thụ tinh. Với cùng một mức nồng độ tinh, trứng loại A , B1 cho tỷ lệ tinh trùng xâm nhập tƣơng đƣơng nhau và cao hơn so với trứng loại B2. Với mức nồng độ tinh 0,05 triệu tt/ml ,0,1 triệu tt/ml và 1 triệu tt/ml tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng vào
Tỷ lệ xâm n h ập c ủ a tinh t rù n g (% ) Nồng độ tinh trùng
Khả năng xâm nhập của tinh trùng
A B1 B2
trứng loại A, B1 lần lƣợt là (36,2 ± 2,6%, 29,4 ± 1,3%) (60,3 ± 1,9% sv 50,7 ± 4,1%) và (70,8 ± 1,4%, 66,6 ± 1,1%) cao hơn so với trứng loại B2 (22,3 ± 1,7%, 31,6 ± 2,3% và 43,5 ± 2,0), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05.
Tiếp theo, chúng tôi đánh giá ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng hình thành tiền nhân của trứng lợn thụ tinh ống nghiệm. Kết quả thể hiện ở biểu đồ 4.2
Biểu đồ 4.2. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng hình thành tiền nhân Chất lƣợng trứng ảnh hƣởng tới khả năng hình thành tiền nhân của trứng lợn sau thụ tinh ống nghiệm. Ở mức nồng độ tinh 0,05 triệu tt/ml, trứng A và B1 cho tỷ lệ hình thành tiền nhân là tƣơng đƣơng (60,6 ± 3,2%, 56,2 ± 3,1%) cao hơn so với tỷ lệ hình thành tiền nhân của trứng B2 (38,7 ± 5,6%), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05. Không có sự khác biệt trong tỷ lệ hình thành tiền nhân giữa các nhóm chất lƣợng trứng ở mức nồng độ tinh 1 triệu tt/ml. Tuy nhiên, ở mức nồng độ tinh 0,1 triệu tt/ml, trứng A cho tỷ lệ hình thành tiền nhân
0,05 triệu tt/ml 0,1 triệu tt/ml 1 triệu tt/ml
A 60.60 85.08 69.86 B1 56.19 78.60 63.37 B2 38.67 51.96 56.80 Tỷ lệ h ìn h th ành ti ền n h ân (% )
cao nhất rồi đến trứng B1, B2 lần lƣợt là (85,1 ± 3,7% sv 78,6 ± 2,5% sv 51,9 ± 3,9%). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0,05.
Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng thụ tinh bình thƣờng của tế bào trứng lợn đƣợc thể hiện trong biểu đồ 4.3
Biểu đồ 4.3. Ảnh hƣởng của chất lƣợng trứng tới khả năng thụ tinh bình thƣờng của tế bào trứng lợn.
Chất lƣợng trứng cũng ảnh hƣởng tới khả năng thụ tinh bình thƣờng của của tế bào trứng lợn. Trứng A, B1 cho tỷ lệ thụ tinh bình thƣờng đƣơng nhau (P>0,05) và cao hơn có ý nghĩa so với tỷ lệ này ở nhóm trứng B2 (P<0,05) (43,1% và 40,48% sv 19%; 64,28% và 59,42% sv 25,47%; 41,36% và 37,88% sv 15,75%) tƣơng ứng ở ba mức nồng độ tinh là 0,05 triệu tt/ml, 0,1 triệu tt/ml và 1 triệu tt/ml
Chất lƣợng trứng ảnh hƣởng tới khả năng thụ tinh bình thƣờng của tế bào trứng lợn đã đƣợc xác nhận. Theo Suzuki, 2003 (Suzuki vcs., 2003) [51], tỷ lệ
0,05 triệu tt/ml 0,1 triệu tt/ml 1 triệu tt/ml
A 43.10 64.28 41.36 B1 40.48 59.42 37.88 B2 19.00 25.47 15.75 Tỷ lệ th ụ tin h b ìn h t h ườn g (% )
đa tinh trùng của nhóm chất lƣợng tốt (có trên 3 lớp tế bào cận noãn) đƣợc thụ tinh từ tinh trùng của lợn Đại Bạch là 2,3%, thấp hơn có ý nghĩa so với các nhóm chất lƣợng khác dao động từ 14,3 – 35,6% (P<0,05) đối với lợn Landrace và 38,1% so với các nhóm khác dao động từ 48,6 – 58,5% (P<0,05) đối với lợn Đại Bạch
4.5 Ảnh hƣởng của nồng độ tinh sự phát triển và chất lƣợng của phôi lợn.
Để đánh giá ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới sự phát triển tiếp theo của tế bào trứng lợn. Trứng sau thụ tinh đƣợc nuôi 48 giờ trong môi trƣờng IVC pyrlac. Tỷ lệ chia đƣợc đánh giá ở ngày thứ 2, tỷ lệ phôi nang đƣợc đánh giá ở ngày thứ 6 sau thụ tinh (ngày thụ tinh đƣợc tính là ngày 0). Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới sự phát triển và chất lƣợng phôi lợn thể hiện qua bảng 4.7-4.9
Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh tới sự phát triển tiếp theo của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm với trứng loại A
Nồng độ tinh (tt/ml) Số trứng TN Tỷ lệ chia (%) Tỷ lệ phôi nang (%)