4.3 Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm lợn thụ tinh ống nghiệm
Để đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới khả năng phát triển của trứng lợn sau thụ tinh ống nghiệm, trứng đƣợc nuôi thành thục, thụ tinh sau đó chuyển vào môi trƣờng nuôi phôi.
Khả năng phát triển của phôi đƣợc đánh giá bằng tỷ lệ phân chia của phôi ở ngày thứ 2 (ngày thụ tinh đƣợc tính là ngày 0), và tỷ lệ hình thành phôi nang ở
ngày thứ 6. Phôi nang là những phôi to hơn bình thƣờng, căng phồng và có khoang phôi. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 4.3
Bảng 4.3 : Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới sự phát triển tiếp theo của tế bào trứng lợn
Thí nghiệm được lặp lại 5 lần.
Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, P<0,05.
Qua bảng ta thấy, tỷ lệ phân chia của phôi trong ba loại môi trƣờng đối chứng, thí nghiệm 1 (TCM 199 10% FBS), thí nghiệm 2 (TCM 199 10% pFF) tƣơng ứng là (50,0 ± 3,5%, 74,0 ± 3,2%, 70,0 ± 6,8%). Trong đó, tỷ lệ chia của trứng trong môi trƣờng bổ sung FBS cao hơn so với môi trƣờng bổ sung pFF ( P>0,05). Tỷ lệ chia của phôi trong hai loại môi trƣờng thí nghiệm đều cao hơn đối chứng (74,0 ± 3,2%, 70,0 ± 6,8% sv 50,0 ± 3,5%). Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với P<0,05.
Trong thí nghiệm của Wang vcs., 1997 [53], tác giả cũng đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục tới sự phát triển tiếp theo của tế bào
Môi trƣờng Số trứng TN Số phôi phân chia (%) Số phôi nang (%) Số tế bào trung bình NCSU-37 (đối chứng). 158 79 (50,0 ± 3,5) b 10 (6,3 ± 1,0)c (18,5 ± 2,3)b TCM 199 10% FBS 253 187 (74,0 ± 3,2)a 34 (13,4 ± 1,9)b (28,5 ± 1,6)a TCM 199 10% pFF 266 186 (70,0 ± 6,8) a 52 (19,6 ± 1,2)a (31,7 ± 1,5)a
trứng lợn sau thụ tinh in vitro. Trứng sau khi nuôi thành thục trong ba môi trƣờng NCSU 23, TCM 199 và mWM đƣợc thụ tinh ống nghiệm. Ở 48 giờ sau thụ tinh ống nghiệm, 61-70% trứng phân chia (NCSU 70%, TCM 199 và mWM (61%). Kết quả này tƣơng đƣơng với kết về tỷ lệ chia trong các môi trƣờng chúng tôi thực hiện.
Tỷ lệ phôi nang của tế bào trứng trong ba nhóm môi trƣờng trƣờng đối chứng, thí nghiệm 1 (TCM 199 10% FBS), thí nghiệm 2 (TCM 199 10% pFF) lần lƣợt là (6,3 ± 1,0%, 13,4 ± 1,9%, 19,6 ± 1,2%), trong đó, trứng nuôi trong môi trƣờng bổ sung pFF thể hiện ƣu thế về tỷ lệ hình thành phôi nang là so với môi trƣờng bổ sung FBS và môi trƣờng đối chứng (19,6 ± 1,2% sv 13,4 ± 1,9%, 6,3 ± 1,0%). Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với P<0,05. Tỷ lệ hình thành phôi nang của trứng nuôi trong môi trƣờng bổ sung FBS cũng cao hơn có ý nghĩa so với môi trƣờng đối chứng (13,4 ± 1,9%, 6,3 ± 1,0%) P<0,05
Tỷ lệ hình thành phôi nang ở ngày thứ 6 trong môi trƣờng NCSU 23 sử dụng trong nghiên cứu của Wang vcs., 1997 [53] cao hơn có ý nghĩa so với TCM 199 và mWM tƣơng ứng là (27a sv 15b, 4c %) với P<0,05. Số tế bào trung bình ở ngày thứ 7 trong mỗi phôi nang của ba loại môi trƣờng tƣơng ứng là (36,8 ± 17a, 30,7 ± 13,3ab, 29,4 ± 12b). Nhƣ vậy trong nghiên cứu của Wang vcs., 1997 [53] thì môi trƣờng NCSU 23 thể hiện ƣu thế cả về tỷ lệ hình thành phôi nang và số tế bào trong mỗi phôi nang so với môi trƣờng TCM 199 và mWM. Môi trƣờng NCSU 23 cũng là môi trƣờng thành công và đƣợc nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới sử dụng [11, 24, 51]
Kết quả về số tế bào trung bình/phôi nang. Số tế bào trung bình/phôi nang của nhóm thí nghiệm bổ sung pFF cao nhất (31,7 ± 1,5), cao hơn so với nhóm bổ sung FBS tƣơng ứng là (31,7 ± 1,5 sv 28,5 ± 1,6) , sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê P>0,05. Cả hai nhóm này đều có số tế bào / phôi nang cao hơn so với nhóm đối chứng (31,7 ± 1,5, 28,5 ± 1,6 sv 18,5 ± 2,3) P<0,05. Số tế bào trong mỗi phôi
nang trong nghiên cứu này là tƣơng đƣơng và ổn định hơn so với nghiên cứu của tác giả Wang vcs., 1997 [53]. Tỷ lệ hình thành phôi nang trong môi trƣờng NCSU 23 (27%) cao hơn có ý nghĩa so với tỷ lệ này trong môi trƣờng TCM 199 (19%) P<0,05. Tỷ lệ hình thành phôi nang của trứng nuôi trong môi trƣờng mWM là thấp nhất và chỉ đạt (4%)
Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi thành thục trong hệ thống IVM/IVF đã đƣợc nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu. Các loại môi trƣờng đƣợc bổ sung thêm một số chất nhƣ cystein, pFF, FBS…Những chất này đã đƣợc chứng minh là giúp tăng tỷ lệ thành thục, tăng tỷ lệ hình thành tiền nhân của tế bào trứng lợn (Singh vcs., 1997) [49] thành thục, thụ tinh ống nghiệm.n
Trong nghiên cứu này, trứng lợn nuôi trong môi trƣờng NCSU 37 cho tỷ lệ thành thục nhân cao hơn nhƣng khả năng thụ tinh và phát triển phôi lại kém hơn so với môi trƣờng TCM 199. Tuy nhiên, tỷ lệ tinh trùng xâm nhập (trứng đƣợc thụ tinh), tỷ lệ hình thành tiền nhân, tỷ lệ trứng thụ tinh bình thƣờng, tỷ lệ chia, hình thành phôi nang, số tế bào/phôi nang của môi trƣờng TCM 199 bổ sung FBS và pFF cao hơn có ý nghĩa thống kê so với môi trƣờng NCSU 37 (P<0,05). Nhƣ vậy môi trƣờng TCM 199 10% pFF là môi trƣờng tốt nhất. Cả pFF và FBS đều có vai trò cải thiện khả năng thành thục, thúc đẩy sự phát triển tiếp theo của tế bào trứng lợn. Trong đó, pFF là nguồn nguyên liệu thu từ dịch nang trứng của những nang trứng to (nang >3mm) trên bề mặt buồng trứng lợn, đây là nguồn nguyên liệu dễ kiếm nhƣng lại là nguồn tiềm tàng lây nhiễm. Trong khi đó, FBS có độ tinh sạch cao và rất sẵn trên thị trƣờng.
Mặc dù môi trƣờng TCM 199 10% pFF là môi trƣờng tốt nhất nhƣng do tính chất thí nghiệm tiến hành vào mùa hè, khả năng nhiễm khuẩn cao nên chúng tôi lựa chọn môi trƣờng tốt thứ hai là môi trƣờng TCM 100 10% FBS dùng trong các nghiên cứu tiếp theo.
Phần II. Ảnh hƣởng của nồng độ tinh, chất lƣợng trứng tới khả năng