2.2.2.1. Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên
Vi khuẩn B. subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ, cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường đất trồng trọt có khoảng 106 - 107 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì (trong bột mì vi khuẩn B. subtilis chiếm 75 - 79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo, trong các thực phẩm như mắm, tương, chao… B. subtilis đóng vai trò đáng kể về mặt có lợi cũng như mặt gây hại trong quá trình biến đổi sinh học.
- B. subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon trong khi một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần các hợp chất hữu cơ là vitamin và amino acid cho sự sinh trưởng. Đặc biệt các loài như Bacillus popilliae, Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB).
- Năm 1993, giáo sư Richard Losik và cộng sự thuộc Đại học Havard ở Boston (Mỹ) và Jose Gonzalez - Pastor của Trung tâm công nghệ sinh học quốc gia ở Madrid (Tây Ban Nha) đã chứng minh được loài B. subtilis có tập tính ăn thịt đồng loại. Chúng dùng cách này như một phương pháp đơn giản để thoát khỏi những trường hợp có đời sống giới hạn như dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt. Một cách đơn giản là các cá thể khỏe mạnh sinh tổng hợp kháng sinh tiêu diệt những cá thể xung quanh cả khác loài lẫn cùng loài, để thu lấy chất dinh dưỡng bên trong, giúp chúng sống sót chờ đến khi môi trường thuận lợi hơn. Ngoài ra, để tránh những ảnh hưởng của môi trường khắc nghiệt, chúng thường tạo ra bào tử, nhưng cách này tiêu hao khá nhiều năng lượng.[30]
2.2.2.2. Phân loại vi khuẩn
Sau khi tiến hành phân lập và định tên người ta đã xác định rằng Natto là loại thực phẩm lên men tương đối thuần khiết. Vi khuẩn đóng vai trò chủ yếu trong Natto là loài Bacillus subtilis chủng Natto. [31]
Bacillus subtilis được phát hiện và đặt tên vào năm 1872, nó phân bố phổ biến trong đất, đặc biệt trong cỏ khô nên còn có tên gọi khác là trực khuẩn cỏ khô. [31]
Ngành: Firmicutes Lớp: Trực khuẩn Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
2.2.2.3. Hình dạng vi khuẩn và hình thái của khuẩn lạc
Là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ và kích thước từ 3µm đến 5µm. Các tế bào nối với nhau thành chuỗi dài ngắn khác nhau hoặc tế bào đứng riêng lẽ. [32]
Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch.
Bào tử hình bầu dục, kích thước 0.6-0.9µm, phân bố lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm. Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử B.subtilis trong 200 - 300 năm.[32] Vi khuẩn B.subtilis có màng nhày (giác mạc) giúp vi khuẩn có khả năng chịu đựng được điều kiện thời tiết khắc nghiệt, vì màng nhày có thể dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh tổn thương khi khô hạn. Màng nhày có thể quan sát được khi nhuộm tiêu bản, qua kính hiển vi thấy màng nhày không màu, trong suốt còn tế bào vi khuẩn bắt màu nâu đỏ trên nền tiêu bản xanh hoặc đen.[32]
2.2.2.4. Đặc điểm sinh lý
Trong giống Bacillus subtilis là loài có tính đa dạng rất lớn về mặt sinh lý. Những đặc tính của chúng bao gồm:
Khả năng phát triển trong khoảng pH rộng 5,4 – 8,0; khoảng nhiệt độ lớn 9 – 550C. [31], [32]
Các Bacillus subtilis có khả năng thuỷ phân nhanh chóng hầu hết các cơ chất có nguồn gốc động thực vật gồm xenlulose, tinh bột, pectin, protein, agar, hydrocacbon, gelatin…có khả năng lên men các loại đường như glucose, arabinose, xylose, manitol và có khả năng sử dụng citrat. [31], [32]
Ngoài ra các chủng này còn có hoạt tính bacteriocin, tạo ra các chất subtilisin; tạo axit từ các đường; nitrat hoá; phản nitrat hoá; cố định nitơ; tự dưỡng; hô hấp tuỳ nghi; là vi khuẩn ưa axit; ưa kiềm; ưa nhiệt; ưa tối; sống ký sinh; hầu hết tạo bào tử nên có khả năng sống sót cao trong môi trường, ở bất kỳ nơi nào chúng chiếm ưu thế. [31], [32]
Môi trường thuận lợi để Bacillus subtilis phát triển tốt là môi trường LB hoặc môi trường thạch dinh dưỡng NA. [31], [32]
2.2.2.5. Tiêu chuẩn chọn giống
Khả năng sinh tổng hợp độc tố thấp.
Tạo ra tỉ lệ hàm lượng các sản phẩm trao đổi chất cân đối và ảnh hưởng tốt tới giá trị cảm quan của sản phẩm.
Khả năng thích nghi và tốc độ sinh trưởng cao để rút ngắn thời gian lên men, lấn át các vi sinh vật tạp nhiễm.
Điều kiện nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền.
Hoạt tính trao đổi chất ổn định.