2. Microsporidia
2.5.2. Chẩn đoán xác định
Chẩn đoán xác định dựa vào tìm thấy bào tử Microsporidia trong phân sau khi nhuộm bằng các phương pháp đặc biệt như Weber chromotrope, hóa huỳnh quang, Gram – chromotrope.
Các bệnh phẩm khác như nước tiểu, đờm, dịch rửa phế quản, dịch tá tràng, phết từ màng nhày mũi, giác mạc, kết mạc. Ly tâm lấy cặn nhuộm bằng các phương pháp như Gram, Weber chromotrope, Giemsa,Steiner bạc, trichorome blue cải biến. PAS, kháng thể huỳnh quang đặc hiệu. Nhuộm gram bào tử ăn màu gram dương rất rõ, nhưng đôi khi ăn màu gram âm hay gram dương yếu.
Nhuộm mô giải phẫu bệnh từ mẫu sinh thiết hay giải phẫu thì từ các mô bệnh như giác mạc, kết mạc, xương cơ, ruột non, ruột già, gan, túi mật, mạc treo, thận, bọng đái, khí quản, phế quản. xương, não. Ở bệnh nhân nhiễm trùng ở mặt
– ruột, hỗng tràng và hồi tràng có mật độ nhiễm kí sinh trùng này cao nhất, phương pháp nhuộm thường là Giemasa, PAS, methenamine bạc, Ziehl – Neelsen, Kinyoun.
Các phương pháp khác như kháng thể huỳnh quang, sinh học phân tử PCR, cấy mô, kính hiển vi điện tử ngoài việc chẩn đoán còn giúp định danh loài
Microsporidia [2, 11].
2.5.2.1. Phương pháp nhuộm soi
Trong điều trị viêm loét giác mạc do Microsporidia, việc chẩn đoán sớm có ý nghĩa vô cùng quan trọng giúp cho việc điều trị đúng hướng ngay từ đầu.
Có nhiều phương pháp chẩn đoán cận lâm sàng như soi tươi, soi trực tiếp, ELISA, PCR…nhưng kỹ thuật thường được áp dụng là soi trực tiếp. Nguồn bệnh phẩm được lấy từ chất nạo ổ loét giác mạc bằng thìa nạo chắp nhỏ hoặc
Spatula Kimura hay đầu của kim tiêm trong da.
Mặc dù nhiều đánh giá so sánh về hiệu quả của các phương pháp nhuộm trong việc xác định Microsporidia trong các mẫu phân, mật, nước tiểu và tiêu bản phổi, đánh giá về hiệu quả trong xác định Microsporidia trên mẫu tiêu bản của mắt vẫn còn hạn chế. Mẫu giác mạc được lấy từ bệnh nhân được chẩn đoán mà mắc Microsporidia sau đó đem đi dàn trên lam kính.
Cho đến nay ở nước ta, chẩn đoán vẫn chủ yếu dựa vào hình ảnh tổn thương trên lâm sàng và kết quả nhuộm soi. Tổn thương do Microsporidia
mặc dù có những đặc điểm đặc trưng nhưng không phải lúc nào cũng rõ ràng và dễ dàng cho chẩn đoán.
Đây là một xét nghiệm không thể thiếu, giúp chẩn đoán chính xác tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên, kỹ thuật nhuộm soi có độ đặc hiệu thấp chỉ áp dụng đối với những ca nhiễm điển hình có hình thái rõ ràng, dễ nhận định nên đã bỏ sót một tỷ lệ khá lớn các trường hợp bị bệnh [1].
Mặc dù phương pháp nhuộm vi sinh hiệu quả và đặc hiệu trong việc chẩn đoán, xác định Microsporidia ở mắt, nó yêu cầu phải có sự tham gia của các chuyên gia, đặc biệt vẫn chưa có phương pháp chẩn đoán từ mẫu lam kính. Thêm vào đó, phương pháp nhuộm này không xác định được loài khác nhau của
Microsporidia. Do đó, hiện nay trên thế giới đã tập trung nghiên cứu phát triển kỹ thuật PCR và Realtime PCR hỗ trợ cho chẩn đoán Microsporidia [10, 15].
A. Phương pháp PCR (Theo Kary Mullis và cộng sự năm 1985) Nguyên tắc
Sử dụng ADN polymerase chịu nhiệt để tổng hợp các đoạn ADN mới từ mạch khuôn trong môi trường có các dNTP và cặp mồi đặc hiệu. Các đoạn ADN mới được tạo thành lại được sử dụng làm khuôn. Sau nhiều chu kỳ, đoạn ADN quan tâm được nhân lên gấp bội, nhờ vậy có thể có đủ số lượng phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo.
Mỗi một chu kỳ PCR gồm 3 giai đoạn sau:
- Giai đoạn biến tính: ADN mạch kép tách thành hai mạch đơn nhờ nhiệt độ cao (940C-960C).
- Giai đoạn gắn mồi: ở nhiệt độ thích hợp, hai mồi sẽ bám vào hai đầu của đoạn ADN đích theo nguyên tắc bổ sung.
- Giai đoạn kéo dài chuỗi: nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng được tăng lên khoảng 70-800C là nhiệt độ thích hợp để cho Taq ADN polymerase kéo dài chuỗi. Trong việc xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật khuếch đại trình tự gen( PCR). Để khuyếch đại đoạn gen tiểu phần nhỏ SSU rRNA( đặc hiệu cho loài) của Microsporidia, sử dụng cặp mồi MF1 và MF2 đã đc Polly công bố năm 2011. Cặp mồi này đc tác giả khuyến cáo đc dùng để phát hiện chủng
Microsporidia trên mẫu bệnh phẩm. Để khẳng định bộ mồi này có thể phát hiện được chủng Microsporidia trên mẫu bệnh phẩm mắt của các bệnh nhân viêm loét giác mạc thì tiến hành tách chiết nhuộm soi 1 mẫu dương tính sau đó tiến hành khuyếch đại trình tự gen. Sau khi tiến hành khuyếch đại gen, để khẳng định lại tính
chính xác thì tiến hành giải trình tự đoạn gen tiểu phần nhỏ SSU rRNA xác định lại kích thước. Đồng thời, so sánh trực tuyến trình tự đoạn gen với ngân hàng gen thế giới (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
Để đánh giá độ nhạy của kỹ thuật PCR, ADN tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm chứa Microsporidia được khẳng định bằng kỹ thuật nhuộm soi và xác định trình tự axít nucleic theo thang pha loãng 1000 lần (ngµ/L - fg/µL). Sau đó tiến hành phản ứng PCR như thành phần và điều kiện phản ứng mô tả như trên.
Độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR được đánh giá trên chủng nấm: Aspergillus sp, Fusarium sp; chủng vi khuẩn: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus và mẫu bệnh phẩm dương tính với HSV, CMV.
B. Phương pháp Realtime PCR
Trong phản ứng PCR kinh điển, sản phẩm khuếch đại được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc, bằng cách điện di ADN trên gel agarose khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, RealTime PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy ADN khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra. Khả năng này được thực hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang báo hiệu sự gia tăng lượng ADN tỷ lệ với sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang. Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết ADN và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với primer gọi là probe. Những máy luân nhiệt đặc biệt trang bị bộ phận phát hiện huỳnh quang được sử dụng để kiểm soát tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xảy ra. Tín hiệu huỳnh quang được đo lường phản ánh lượng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ.
Ưu điểm chính của Real-Time PCR so với PCR truyền thống là nó cho phép xác định số lượng bản sao khuôn mẫu ban đầu với sự chính xác và độ nhạy cao trong một phạm vi biến thiên rộng. Kết quả Real-Time PCR có thể là kết quả định tính (hiện diện hay vắng mặt một trình tự ADN) hay định lượng (số lượng bản sao ADN). Real-Time PCR sử dụng để định lượng ADN được gọi là PCR định lượng.
Đoạn dò TaqMan Probe là đoạn oligonucleotide có trình tự bổ sung với trình tự của đoạn ADN trên mạch khuôn, giới hạn bởi 2 trình tự bổ sung với trình tự của hai 2 đoạn mồi trong phản ứng PCR. Hai đầu của đoạn dò được gắn hai chất gọi là chất phát quang (reporter) và chất ức chế (quencher), khi reporter và quencher ở gần nhau thì quencher làm mất màu của reporter. Ngược lại, khi reporter và quencher ở xa nhau thì reporter phát huỳnh quang. Trong mỗi chu kỳ của phản ứng khuếch đại gene (PCR), đoạn dò và hai đoạn mồi sẽ được gắn vào sợi khuôn DNA đích cần phát hiện. Tiếp đó, Taq DNA polymerase sẽ tổng hợp mạch DNA mới dựa trên trình tự nucleotide của sợi khuôn và đoạn mồi, đồng thời nó cũng phân cắt đoạn dò ra khỏi mạch khuôn khi nó tiến đến vị trí của đoạn dò, trong quá trình này quencher sẽ tách ra khỏi reporter nên làm reporter phát quang. Do đó, lượng phát quang sẽ tỉ lệ thuận với lượng DNA khuếch đại lên. Kỹ thuật Real time PCR dùng đoạn dò TaqMan cho kết quả chính xác.
Hình 1.4. Nguyên lí của phản ứng RealTime PCR sử dụng đầu dò Taqman
Để thuận lợi cho những nghiên cứu tiếp theo, tiến hành tạo nguồn plasmit chuẩn dương Microsporidia sử dụng các kit tinh sạch. Sản phẩm PCR khuyếch đại đoạn gen tiểu phần nhỏ (SSU) rRNA sẽ được gắn vào trong vector PTZ57/RT. Tiến hành đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu của phản ứng Realtime
PCR, kỹ thuật Realtime PCR sử dụng cặp mồi MSRT1 và MSRT2 với probe MSRT chỉ phát hiện đặc hiệu trình tự tiểu phần nhỏ (SSU) rRNA của
Microsporidia mà không bắt cặp không đặc hiệu với các mầm bệnh vi sinh vật khác. Để đánh giá độ nhạy của kỹ thuật Realtime PCR, ADN tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm chứa Microsporidia được khẳng định bằng kỹ thuật nhuộm soi và xác định trình tự axít nucleic theo thang pha loãng 1000 lần (ngµ/L - fg/µL). Sau đó tiến hành phản ứng Realtime PCR như thành phần và điều kiện phản ứng mô tả như trên.
Độ đặc hiệu của kỹ thuật Realtime PCR được đánh giá trên chủng nấm:
Aspergillus sp, Fusarium sp; chủng vi khuẩn: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus và mẫu bệnh phẩm dương tính với HSV, CMV.
Hiện nay, ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về việc ứng dụng kỹ thuật PCR vào việc phát hiện Microsporidia trên các mẫu bệnh phẩm viêm giác mạc. Năm 2015, đã có nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện
Microsporidia trên cỡ mẫu nhỏ [1]. Đề tài chúng tôi thực hiện là tiếp nối từ kết quả của nghiên cứu trước đó và phát triển nghiên cứu thêm ứng dụng kỹ thuật realtime PCR phát hiện Microsporidia trên mẫu bệnh phẩm mảnh giác mạc.
2.5.2.3. Phát hiện Microsporidia trên mẫu bệnh phẩm thu thập được tại bệnh viện trung ương Mắt kết hợp với bệnh viện TW Quân đội 108 từ 2016-2017
Tiến hành trên 30 mẫu bệnh phẩm thu thập được tại bệnh viện trung ương Mắt kết hợp với bệnh viện TW Quân đội 108 từ 2016- 2017.
3. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc ở Việt Nam.