2. Hóa chất, thiết bị
2.3.4. Phương pháp xác định trình tự axit nucleic
Xác định trình tự ADN được tiến hành bằng phương pháp tổng hợp của Sanger cải biến với bộ sinh phẩm xác định trình tự của hãng Beckman. Công việc được tiến hành qua 4 bước.
Bước 1: Phản ứng PCR sequencing
Chuẩn bị phản ứng trong ống epeendrof 0.2ml với các thành phần như sau:
Thành phần phản ứng Thể tích phản ứng (µL) DNTP 6 Mồi xuôi (10pM) 0.5 Khuôn DNA 1.5 H2O 7 Tổng thể tích phản ứng 15
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR sequencing:
960C --- 20 giây
550C --- 20 giây 30 chu kỳ 600C --- 4 phút
40C ---
Bước 2: Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự
- Chuẩn bị ống eppendrof 0,5ml (đã khử trùng, số lượng ống tương đương với số lượng mẫu cần tinh sạch).
- Thêm vào mỗi ống 0,5ml hỗn hợp dung dịch dừng phản ứng (Stop Solution) với các thành phần và thể tích như sau:
3M Natri Acetate pH 5,2 2µl
100 mM Na2EDTA pH 8.0 2µl
20 mg/ml Glycogen 1µl
- Chuyển toàn bộ dung dịch phản ứng PCR giải trình tự vào ống 0,5ml đã có hỗn hợp Stop Solution và vortex trong vài giây.
- Thêm vào mỗi ống 60l Ethanol lạnh 96% (được bảo quản trong tủ lạnh – 200C), vortex và ly tâm với tốc độ 13200 vòng/phút trong 30 phút ở 40C. Cẩn thận hút bỏ dung dịch (giữ lại ADN tủa ở đáy ống).
- Rửa ADN tủa bằng cách thêm 200L Ethanol lạnh 70% (bảo quản trong tủ lạnh -200C, không dùng cồn để quá lâu) và ly tâm với tốc độ 13200 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Cẩn thận hút bỏ dung dịch. (Bước này được thực hiện 2 lần).
- Quay khô chân không trong vòng 10 phút hoặc cho đến khô.
- Hoà tan ADN tủa vào trong 40µL SLS (cung cấp kèm theo DTCS Quick Start Kit)
Bước 3: Chuẩn bị mẫu để đưa vào máy giải trình tự
- Chuyển toàn bộ dung dịch ADN hoà tan trong SLS từ bước tinh sạch vào giếng tương ứng trên đĩa chạy mẫu (Sample plate).
- Nhỏ một giọt dầu (mineral oil) lên trên (để tránh bay hơi mẫu, mineral oil được cung cấp kèm theo DTCS Quick Start Kit).
- Bổ sung dung dich Buffer Solution vào trong các giếng tương ứng trên đĩa Buffer plate (chú ý vị trí các giếng tra buffer phải khớp với vị trí các giếng tương ứng trên Sample pate).
Bước 4: Xác định trình tự trên máy CEQ 8800 sequencer, Beckman Coulter, Mỹ.