2. Hóa chất, thiết bị
3.3. Thiết kế tạo plasmid chuẩn dương Microsporidia
Theo trình bày ở phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu, chúng tôi thực hiện cloning đoạn trình tự khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA ribosomal của
Microsporidia vào trong vector pTZ57R/T để tạo vector tái tổ hợp pTZ57RR/T-
Microsporidia bằng phản ứng ligation dưới xúc tác của enzyme T4 ligage.
Sản phẩm của phản ứng ligation sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến
E. Coli DH5α. Các khuẩn lạc sẽ được chọn lọc trên đĩa thạch có trải kháng sinh ampicillin và IPTG/XGal. Các khuẩn lạc cho kết quả dương tính là các khuẩn lạc mọc trên đĩa có màu trắng, các khuẩn lạc không xảy ra phản ứng ligation sẽ cho màu xanh do xảy ra phản ứng cảm ứng với IPTG/XGal.
Hình 3.9A. Kết quả điện di sản phẩm PCR clony kiểm tra kết quả phản ứng ligation tạo plasmid chuẩn dương microsporida bằng cặp mồi vector M13.
Đường chạy số 1: plasmid pTZ57R/T làm đối chứng âm. Đường chạy số 2 đến 6 và 10 đến 12 là các khuẩn lạc nghi ngờ có chứa plasmid pTZ57R/T-
Microsporidia. Đường chạy số 8,9 là các khuẩn lạc nghi ngờ âm tính. M: thang chuẩn ADN.
Cặp mồi vector M13 có vị trí gắn đặc hiệu trên vector pTZ57R/T cho phép khuếch đại đoạn gen có kích thước 152bp hoặc 406bp tương ứng với các dòng mang và không mang plasmid tái tổ hợp pTZ57R/T-Microsporidia.
Chúng tôi tiến hành chọn một khuẩn lạc nghi ngờ dương tính có chứa plasmid pTZ57R/T-Microsporidia để tiến hành tách plasmid và chạy kiểm chứng lại bằng phản ứng Colning DNA.
Hình 3.9B. Kết quả điện di sản phẩm plasmid PCR bằng cặp mồi vector M13 trên plasmid nghi ngờ mang đoạn gen Microsporidia.
Đường chạy số 1: plasmid tách từ khuẩn lạc nghi ngờ chứa plasmid pTZ57R/T- Microsporidia. M: thang chuẩn ADN.
Kết quả từ hình 3.9b cho thấy, khuẩn lạc nghi ngờ có chứa plasmid plasmid pTZ57R/T-Microsporidia khi sử dụng cặp mồi đặc hiệu vector M13 nhân lên được đoạn gen có kích thước hơn 400bp (bao gồm đoạn gen của vector + đoạn chèn ADN Microsporidia). Từ đó khẳng định, chúng tôi đã cloning được đoạn gen khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA ribosomal của Microsporidia vào trong vector pTZ57R/T.
Để sử dụng plasmid chuẩn dương đã tạo được làm chuẩn dương sử dụng trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành đo OD, tính số bản copies tương ứng
của plasmid sau đó tiến hành pha loãng xuống các nồng độ thấp hơn. Sau đó, chúng tôi tiến hành chạy PCR và Realtime PCR để chọn được nồng độ plasmid lấy làm chuẩn dương thích hợp.
Hình 3.10. Kết quả Realtime PCR trên mẫu plasmid chuẩn dương Microsporidia pha loãng nồng độ. Đường tín hiệu từ 1 đến 7: plasmid chuẩn
dương pha loãng nồng độ lần lượt 108, 107,106,105,104,103,102.
Hình 3.11. Kết quả Realtime PCR trên mẫu plasmid chuẩn dương Microsporidia pha loãng nồng độ.
Đường chạy từ 1 đến 7: plasmid chuẩn dương pha loãng nồng độ lần lượt 108, 107,106,105,104,103,102. Đường chạy số 8: chuẩn âm. M: thang nồng độ ADN.
Từ kết quả ở Hình 3.10 và 3.11, chúng tôi lựa chọn nồng độ 103 làm nồng độ plasmid chứng dương sử dụng trong nghiên cứu sau này. Ở nồng độ này, đảm bảo được quá trình PCR và Realtime PCR không xảy ra hiện tượng dương tính giả do nhiễm chéo, đảm bảo tính ổn định của phản ứng.